改进的磷脂酶及其制备方法和用图
【专利说明】改进的磯脂酶及其制备方法和用途 发明领域
[0001] 本申请大体上涉及磯脂酶及其工业应用。具体而言，本申请涉及利用分子生物学 手段对磯脂酶进行改造，改造后的磯脂酶可应用于，例如，油脂精炼的脱胶工艺中。
[0002] 发明背景
[0003] 植物油中存在的磯脂为油脂精炼带来了一定的技术问题。脱胶是植物油精炼中重 要的一步，是指去除溶解在油脂中的各种磯脂类物质的过程。一般而言，脱胶方式可分为H 种，包括化学脱胶（例如水化脱胶、酸法脱胶等）、物理脱胶（例如，膜过滤脱胶）和生物学 脱胶（例如，酶法）。随着生物技术的发展，植物油的脱胶过程已经越来越多地采用酶法进 行。酶法脱胶是利用磯脂酶水解磯脂的脂肪酸链而生成水化性溶血磯脂，再通过水化方法 除去。同传统的脱胶方法相比，酶法脱胶反应条件温和，可大大节约化学物质的消耗，几乎 不产生废水，在环保、经济、质量等方面具有潜在的优势[1]。
[0004] 磯脂酶脱胶的效率受多种因素的影响。例如，磯脂酶反应发生在油水界面上，因此 增加酶与底物之间的油水界面面积，能够使磯脂酶高效地发挥作用。目前，本领域中通常的 做法是在反应过程中采用强剪切力揽拌等方式使磯脂酶保留在油水界面上。
[0005] 因此，本领中仍亟需提高磯脂酶活性和反应效率的新方法。
[000引发明概述
[0007] 第一方面，本申请提供了融合蛋白，其包含磯脂酶部分和蛋白的疏水结构域部分。
[0008] 在一些实施方案中，磯脂酶为磯脂酶C。
[0009] 在一些实施方案中，磯脂酶为化0PLC8 (GenBank :049969. 1)。
[0010] 在一些实施方案中，磯脂酶部分的序列如SEQ ID NO: 1所示，或者为保留磯脂酶活 性的SEQ ID NO: 1的同源物、变体或片段，所述变体优选为保守性变体。
[0011] 在一些实施方案中，蛋白为油体蛋白。
[0012] 在一些实施方案中，油体蛋白选自来自大豆、花生、芝麻、芥菜、油菜、向日葵、玉米 和棉花的油体蛋白。
[0013] 在一些实施方案中，油体蛋白为大豆油体蛋白。
[0014] 在一些实施方案中，油体蛋白的疏水结构域部分为包含有脯氨酸结的疏水结构域 部分，优选的，所述疏水结构域部分的序列如SEQ ID N0:5所示，或者为保留了疏水性的SEQ ID N0:5的同源物、变体或片段，所述变体优选为保守性变体。
[0015] 在一些实施方案中，SEQ ID N0:5的同源物、变体或片段为保留了脯氨酸结的SEQ ID N0:5的同源物、变体或片段，所述变体优选为保守性变体。
[0016] 在一些实施方案中，蛋白的疏水结构域部分是蛋白的跨膜结构域部分。
[0017] 第二方面，本申请提供了核酸分子，其能够编码第一方面所述的融合蛋白。
[0018] 在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 6所示的多核巧酸。
[0019] 第H方面，本申请提供了表达载体，其包含第二方面所述的核酸分子。
[0020] 本申请还提供了表达载体，其包含磯脂酶的编码核酸和蛋白的疏水结构域的编码 核酸。
[0021] 在一些实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 6所示的多核巧酸。
[0022] 第四方面，本申请提供了包含第一方面所述的融合蛋白、或第二方面所述的核酸 分子、或第H方面所述的表达载体的宿主细胞。
[0023] 第五方面，本申请提供了第二方面所述的核酸分子，或第H方面所述的表达载体、 或第四方面所述的宿主细胞在制备磯脂酶中的用途。
[0024] 第六方面，本申请提供了提高磯脂酶活性的方法，包括将磯脂酶与蛋白的疏水结 构域融合。
[00巧]第走方面，本申请提供了通过第六方面所述的方法获得的融合磯脂酶。
[0026] 第八方面，本申请提供了油脂脱胶方法，包括将第一方面所述的融合蛋白或第走 方面所述的融合磯脂酶与油脂接触。
[0027] 在一些实施方案中，所述方法包括在接触之前，将融合蛋白或融合磯脂酶进行乳 化处理的步骤。
[0028] 第九方面，本申请提供了根据第八方面的方法制备的脱胶油脂。
[0029] 附图简要说明
[0030] 图 1 显不了通过 Protscale 软件(http://web, expasv. org/protscale/)对大豆 油体蛋白的疏水结构域的分析图。
[0031] 图2显示了通过凝胶电泳和染色，分析磯脂酶（CLO)和磯脂酶-油体蛋白疏水结 构域融合蛋白（化0-0)的表达水平，最左侧泳道为分子量标记，1号泳道显示了加入诱导剂 之前的菌株样品的蛋白表达，2号泳道显示了加入诱导剂之后磯脂酶（CLO)的表达水平，3 号泳道显示了加入诱导剂之后磯脂酶-油体蛋白疏水结构域融合蛋白（化0-0)的表达水 平。
[003引图3显示了磯脂酶（CLO)和磯脂酶-油体蛋白疏水结构域融合蛋白（CLO-O)的定 量分析。1-5号泳道依次表示浓度50、100、200、500和1000 U g/mL的BSA溶液的电泳染色 图，6号泳道显示了磯脂酶（CLO)的表达水平，7号泳道显示了磯脂酶-油体蛋白疏水结构 域融合蛋白（化0-0)的表达水平，最右侧泳道为分子量标记。
[0033] 图4显示了磯脂酶CLO和融合蛋白CLO-O的磯酸基团水解活力的比较。
[0034] 图5显示了磯脂酶化0、融合蛋白化0-0 W及对照PLC在乳化前后磯脂水解活力的 比较。
[0035] 图6显示了磯脂水解活力测试中的标准曲线。
[0036] 序列简要说明
[0037] 沈Q ID NO: 1 ;磯脂酶化0PLC8的氨基酸序列；
[0038] 沈Q ID NO:2 ;磯脂酶化0PLC8的编码核酸序列；
[0039] 沈Q ID N0:3 ;大豆油体蛋白的全长氨基酸序列（FJ864730. 1);
[0040] 沈Q ID N0:4 ;大豆油体蛋白的编码核酸序列（FJ864730. 1)
[0041] SEQ ID NO:5 ;大豆油体蛋白的疏水结构域的氨基酸序列；
[0042] SEQ ID N0:6 ;大豆油体蛋白的疏水结构域的编码核酸序列：
[004引 SEQ ID N0:7 ;大豆油体蛋白的疏水结构域的正向扩增引物；
[0044] SEQ ID N0:8 ;大豆油体蛋白的疏水结构域的反向扩增引物；
[004引 SEQ ID NO:9 :磯脂酶化0PLC8的正向扩增引物；
[0046] SEQ ID NO: 10 ;磯脂酶化0PLC8的反向扩增引物。
[0047] 发明的详细描述 [004引定义
[0049] 除非另外说明，本申请中的各个术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相 同。
[0050] 本文所用的术语"多肤"、"肤"和"蛋白"可互换使化通常表示多个氨基酸通过肤 键连接形成的聚合物。
[0051] 本文所用的术语"疏水结构域"、"疏水片段"、"疏水区域"或类似的术语可W按照 相同的含义理解，是指构成蛋白质的疏水结构的区域。
[0052] 本文中使用了国际通用的氨基酸的单字母或H字母缩写。
[0053] 本文所用的术语"核酸"和"多核巧酸"可互换使用，包括但不限于DNA、RNA等。核 巧酸可W是天然存在的或人工合成的类似物。
[0054] 本文所用的术语"细胞"可W是真核细胞或原核细胞，例如，但不限于细菌细胞、真 菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。
[00巧]技术方案的详细描述
[0056] 本申请至少部分地基于利用融合蛋白技术（化Sion Protein Technology)对磯脂 酶进行改造 W提高其性能。
[0057] 通常而言，磯脂酶脱胶过程涉及基于磯脂微囊结构的油水界面问题巧，3]，即，磯 脂脂肪酸链跟H醜甘油形成疏水内核，磯脂亲水头暴露在外共同形成水包油的微囊结构， 磯脂酶反应就发生在油水界面上。因此，在实际应用中，往往采用乳化（强剪切力揽拌）的 方式，增加磯脂酶与底物之间的油水界面面积，使磯脂酶高效发挥作用。但是，由于磯脂酶 常常是亲水的，因此要想使其保留在油水界面上，则理论上需要持续剪切乳化。
[0058] 本申请的发明人发现，通过将蛋白质的疏水结构域与磯脂酶结合在一起，得到的 融合蛋白在反应过程中可保留在油水界面上，避免了通常使用磯脂酶脱胶所必须的持续剪 切乳化工艺。
[0059] 另外，本申请的发明人还特别地发现，油体