一种检测酰基高丝氨酸内酯（ahl）的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测酰基高丝氨酸内酯(AHL)的方法。本发明的方法是将响应AHL的pBQ9载体电击转化导入不产AHL的宿主菌株中，构建检测环境AHL的重组菌株psyI?/pBQ9；并通过外源添加AHL诱导重组菌株表达GFP，利用其相对绿色荧光强弱来测定pBQ9载体对AHL响应的最短时间及其最低浓度。通过实验证明：本发明的重组菌株psyI?/pBQ9可检测环境AHL的最低浓度为100nM，最短诱导或响应时间为2小时。本发明的重组菌株可用来检测环境中是否含有AHL，且检测方法具有灵敏、快速、直观的优点。
【专利说明】
一种检测酰基高丝氨酸内酯(AHL)的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测酰基高丝氨酸内酯(AHL)的方法。
【背景技术】
[0002] 微生物细胞间不是独立的，而是相互作用与交流的。近年来研究表明，微生物细胞 可产生并响应多种化学物质。随着细胞浓度增加其细胞所产生的化学物质也增加或者外界 环境化学物质增加一定阈值时，参与微生物自身或者其他微生物的基因表达，这种现象称 为群体感应(QS)。群体感应作为微生物中一种基因表达的调控方式，它可以参与多种生物 学功能的调控，包括群聚移动、质粒转移、生物膜形成、毒性因子如胞外多糖、抗生素、表面 活性剂等合成。目前，研究最为深入的是革兰氏阴性菌中由酰基高丝氨酸内酯类化合物 (AHL)作为信号分子介导的群体感应。
[0003] 目前，检测细菌是否产AHL或环境是否存在AHL常用的方法以气相或液相色谱法为 基础的化学检测，此类方法耗时费力且仪器设备要求较高。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种重组菌。
[0005] 本发明提供的重组菌为将报告基因和驱动其表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启 动子导入不产酰基高丝氨酸内酯的菌株中得到的菌。
[0006] 上述重组菌中，
[0007] 所述酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的核苷酸序列为序列1的第1-353位。
[0008] 上述重组菌中，所述报告基因为荧光蛋白编码基因。
[0009] 上述重组菌中，所述荧光蛋白编码基因具体为gfp基因；其核苷酸序列为序列1的 第407-1123位。
[0010] 上述重组菌中，所述报告基因和驱动其表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子通 过重组载体导入不产酰基高丝氨酸内酯的菌株中。
[0011] 上述重组菌中，所述重组载体为pBQ9载体。
[0012] 上述重组菌中，所述不产酰基高丝氨酸内酯菌株为丁香假单胞菌烟草致病变种 P.syringae pv.tabaci 11528的酰基高丝氨酸内酯缺陷菌株psyl-。
[0013] 本发明的另一个目的是提供上述重组菌或上述重组载体或上述报告基因和驱动 其表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的新用途。
[0014] 本发明提供了上述重组菌或上述重组载体或上述报告基因和驱动其表达的酰基 高丝氨酸内酯诱导型启动子在检测或辅助检测待测样品中是否含有酰基高丝氨酸内酯中 的应用。
[0015] 本发明还提供了上述重组菌或上述重组载体或上述报告基因和驱动其表达的酰 基高丝氨酸内酯诱导型启动子在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有酰基高丝氨酸 内酯的产品中的应用。
[0016] 本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有酰基高丝 氨酸内酯的方法。
[0017] 本发明提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有酰基高丝氨酸内酯的方法包 括如下步骤:将上述重组菌与待测样品混匀，培养，得到培养液;检测所述培养液中报告基 因是否表达；
[0018] 若培养液中有报告基因表达，则待测样品中含有或候选含有酰基高丝氨酸内酯；
[0019] 若培养液中没有报告基因表达，则待测样品中不含有或候选不含有酰基高丝氨酸 内酯。
[0020] 上述方法中，所述检测所述培养液中报告基因是否表达的方法为通过荧光仪检测 培养液的相对荧光值大小或通过荧光显微镜观察培养液是否有绿色荧光。
[0021 ]上述方法中，所述培养的时间至少为2小时。
[0022]本发明一种检测酰基高丝氨酸内酯(AHL)方法，本发明的方法是将响应AHL的pBQ9 载体电击转化导入不产AHL的宿主菌株中，构建检测环境AHL的重组菌株psyI-/pBQ9;并通 过外源添加 AHL诱导重组菌株表达GFP，利用其相对绿色荧光强弱来测定pBQ9载体对AHL响 应的最短时间及其最低浓度。通过实验证明：本发明的重组菌株psyI-/pBQ9可检测环境AHL 的最低浓度为1〇〇ηΜ，最短诱导或响应时间为2小时。本发明的重组菌株可用来检测环境中 是否含有AHL，且检测方法具有灵敏、快速、直观的优点。
【附图说明】
[0023]图1为不同浓度的外源AHL诱导重组菌株psyI-/pBQ9产生的相对绿色荧光强度。 [0024] 图2为不同浓度的外源AHL对重组菌株psyI-/pBQ9诱导2h、5h和9h时产生绿色荧光 显微观察。
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0028]下述实施例中的LB液体培养基（1L)配方:胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏 水定容至l〇〇〇mL，调pH 7.2; LB固体培养基:LB液体培养基加入终浓度1.5% (W/V)的琼脂。 [0029] 下述实施例中的KB液体培养基（1L)配方：蛋白胨20g，K 2HP〇4l. 5g，MgS〇4.7H20 1.5g，甘油10ml，蒸馏水定容至lOOOmL，调pH 7.2; KB固体培养基:KB液体培养基加入终浓度 1.5%(W/V)的琼脂。
[0030] 下述实施例中的丁香假单胞菌烟草致病变种(P.syringae pv.tabaci 11528)的 酰基高丝氨酸内酯（AHL)缺陷菌株psyl-在文献"Functional analysis of the role of Fur in the virulence of Pseudomonas syringae pv.tabaci 11528:Fur controls expression of genes involved in quorum-sensing.Biochem Biophys Res Commun 366:281-287. doi : 10.1016/j . bbrc. 2007.11.021"中公开过，公众可从中国科学研究院环 境生态研究中心获得。
[0031] 下述实施例中的pBQ9载体和pPROBE-OT载体均在文献"Quiflones,B.，Pujol， C.J.and Lindow,S.E.(2004)Regulation of AHL production and its contribution to epiphytic fitness in Pseudomonas syringae.Mol.Plant-Microbe Interact.17,521-531. "中公开过，公众可从中国科学研究院环境生态研究中心获得。
[0032]实施例1、用于检测AHL的重组菌株psyl7pBQ9的构建 [0033] 一、pBQ9 载体
[0034] pBQ9载体为含有绿色荧光蛋白报告基因和驱动其表达的诱导型启动子?&11的载 体。具体是以pPROBE-OT载体为骨架载体，将诱导型启动子Pahii插入至pPROBE-OT载体中的 绿色荧光蛋白报告基因 gf P的上游，且保持pPROBE-OT载体的其他序列不变得到的载体。其 中，诱导型启动是响应酰基高丝氨酸内酯(AHL)的启动子，且启动下游绿色荧光蛋白 报告基因的表达，含有诱导型启动子P ahn和位于其下游的绿色荧光蛋白报告基因 gfp的片 段的核苷酸序列为序列1，其中，序列1的第1-353位为诱导型启动子PahlI的核苷酸序列，序 列1的第407-1123位为绿色荧光蛋白报告基因 gfp的核苷酸序列。
[0035] 二、丁香假单胞菌烟草致病变种的AHL缺陷菌株psyr的荧光标记及其荧光观察
[0036] 1、丁香假单胞菌烟草致病变种(P. syringae pv.tabaci 11528)的AHL缺陷菌株 psyr感受态细胞的制备
[0037] (l)AHL缺陷菌株psyl-的活化
[0038] 将丁香假单胞菌烟草致病变种(P. syringae pv.tabaci 11528)的AHL缺陷菌株 psyl_接种5ml KB液体培养基中，30°C过夜振荡培养，得到psyr培养液;取psyr培养液于KB 平板划线，置于30°C过夜倒置培养。
[0039] (2)培养 psyl-
[0040] 挑取psyr单菌落于10ml KB液体培养基中，30°C振荡过夜培养，再转接于100ml KB液体培养基中，30 °C振荡培养至对数期(0D6QQ = 0.6-0.7)。
[00411 (3)收集 psyr 细胞
[0042]将步骤(2)获得的培养液低温离心，离心条件为4°C，5，OOOrpm，15min，弃上清收集 细胞。
[0043] (4)水洗 psyl-细胞
[0044]用预冷的无菌水轻柔重悬步骤（3)获得的细胞，低温离心，离心条件为4°C，5， OOOrpm，15min，弃上清。重复操作一次。
[0045] (5)甘油洗psyr细胞
[0046]用预冷的10%甘油轻柔重悬步骤(4)获得的细胞，低温离心，离心条件为4°C，5， OOOrpm，15min，弃上清。重复操作两次。
[0047] (6)分装感受态细胞
[0048] 用200yL预冷的10%甘油轻柔重悬，取50yL分装于1.5mL无菌离心管中，得到psyl- 感受态细胞，于_80°C保存备用。
[0049] 2、重组菌株psyl7pBQ9的获得
[0050]将步骤一得到的pBQ9载体电击转化步骤1得到的psyr感受态细胞中，得到重组菌 株psyr/pBQ9。具体步骤如下：
[0051 ] (1)取lyL pBQ9载体于50yL的psyl_感受态细胞中，轻柔混匀，冰上放置30min，得 到混合液。
[0052] (2)取步骤(1)获得的混合液于电击转化杯(Bio-Rad)中，轻敲杯底排除气泡，在电 击转化仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)模式2条件下进行电击转化。
[0053] (3)立即往电击杯中加入lmL KB液体培养基，混匀，移至1.5mL的离心管中，30°C， 200r/min离心，培养3h。
[0054] (4)离心菌液，弃900yL上清，其余混匀涂布于含有壮观霉素 SpcYSOμg/ml) (Solarbio)的KB固体培养基上，30°C倒置培养，得到重组菌株psyl7pBQ9。
[0055] 将pBQ9载体替换为pPROBE-OT载体，其他步骤不变，得到对照重组菌株psylV pPR0BE-0T〇
[0056] (5)挑取重组菌株psyl7pBQ9单菌落进行PCR扩增验证(PCR验证的引物6??-1:5'_ ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC-3 ' ；GFP-2:5 '-CTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3 '），PCR扩增得 到大小为717bp的即为阳性菌落。挑取对照重组菌株psyl7pPR〇BE-〇T的单菌落进行PCR验 证，未扩增到大小为717bp的条带。
[0057]选取阳性菌落进行扩大培养，即得到用于检测环境AHL的重组菌株pSyr/pBQ9菌 液。
[0058] 实施例2、重组菌株psyl7pBQ9在检测环境AHL中的应用
[0059]由于psyr是AHL缺陷菌株，不能产AHL，所以重组菌株psyl7pBQ9自身不表达绿色 荧光蛋白基因；若环境中存在AHL，则pBQ9载体上响应AHL的启动子?·会启动下游绿色荧 光蛋白基因 gfp的表达，则重组菌株psyI_/pBQ9表达绿色荧光蛋白。因此，向重组菌株psyl7 pBQ9菌液中添加外源标准AHL(如30C6-HSL)，培养一定时间（长于响应的最短时间）后，通过 测定其相对绿色焚光值，即可知重组菌株psyr/pBQ9对AHL响应的最低浓度和最短时间。具 体步骤如下：
[0060] 1、将实施例1中获得的重组菌株psyr/pBQ9菌液接种于KB液体培养基中，30°C、 200r/min培养至对数期(0D600 = 0·6-0.7)，得到psyI-/pBQ9培养液。
[0061 ] 2、分别向 p sy I-/PBQ9 培养液中加入终浓度为 1 OnM、100nM、200nM、500nM、1000nM 和 ΙΟΟΟΟηΜ的30C6-HSL(Sigma，产品目录号为K3255)，同时以不添加30C6-HSL为对照，30°C、 200r/min继续培养，分别得到含有不同浓度的30C6-HSL的psyl7pBQ9培养液。
[0062] 3、分别于培养2h、5h、9h时取样，并利用FL焚光仪（Thermo Fluoroskan Ascent)测 定含有不同浓度的30C6-HSL的psyl7pBQ9培养液样品的相对荧光表达量。
[0063] 结果如图1所示：当外源AHL浓度大于或等于100nM、诱导时间为2h时即可明显地检 测出相对焚光值，表明重组菌株psyr/pBQ9可检测环境AHL的最低浓度为100nM，最短诱导 或响应时间为2小时。
[0064] 4、分别于培养2h、5h和9h时取样，分别取含有不同浓度的30C6-HSL的psyl7pBQ9 培养液5yL置于荧光免疫载玻片上，盖上盖玻片，正置荧光显微镜（Imager A2，Zeiss)观察。 GFP激发光波长设置为488nm，发射光探测波长为510nm〇
[0065] 结果如图2所示：当外源AHL浓度为100nM、诱导2h时，荧光显微观察psyI-/pBQ9菌 液呈现绿色焚光，同样表明psyr/pBQ9可检测环境AHL的最低浓度为100nM，最短诱导或响 应时间为2小时，与图1的结果一致。
[0066] 因此，可通过如下方法检测待测样品或环境中是否含有AHL:
[0067]将待测样品与psyl7pBQ9菌液混匀，培养2小时，得到培养液;通过荧光仪检测培 养液的相对荧光值大小或通过荧光显微镜观察培养液是否有绿色荧光的方法检测培养液 中是否有绿色荧光表达；
[0068] 若培养液中有绿色荧光表达，则待测样品中含有或候选含有酰基高丝氨酸内酯；
[0069] 若培养液中没有绿色荧光表达，则待测样品中不含有或候选不含有酰基高丝氨酸 内酯。
【主权项】
1. 一种重组菌，为将报告基因和驱动其表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子导入不 产酰基高丝氨酸内酯的菌株中得到的菌。2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于： 所述酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的核苷酸序列为序列1的第1-353位。3. 根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于： 所述报告基因为荧光蛋白编码基因； 和/或，所述荧光蛋白编码基因具体为gfp基因。4. 根据权利要求1-3中任一所述的重组菌，其特征在于： 所述报告基因和驱动其表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子通过重组载体导入不 产酰基高丝氨酸内酯的菌株中。5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于： 所述重组载体为PBQ9载体。6. 根据权利要求1-5中任一所述的重组菌，其特征在于:所述不产酰基高丝氨酸内酯菌 株为丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528的酰基高丝氨酸内酯缺陷 菌株psyr。7. 权利要求1 -6中任一所述的重组菌或权利要求1 -6中所述的重组载体或权利要求1 -6 中所述的报告基因和驱动其表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子在检测或辅助检测待 测样品中是否含有酰基高丝氨酸内酯中的应用。8. 权利要求1 _6中任一所述的重组菌或权利要求1 -6中所述的重组载体或权利要求1 -6 中所述的报告基因和驱动其表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子在制备检测或辅助检 测待测样品中是否含有酰基高丝氨酸内酯的产品中的应用。9. 一种检测或辅助检测待测样品中是否含有酰基高丝氨酸内酯的方法，包括如下步 骤:将权利要求1-6中任一所述的重组菌与待测样品混匀，培养，得到培养液;检测所述培养 液中报告基因是否表达； 若培养液中有报告基因表达，则待测样品中含有或候选含有酰基高丝氨酸内酯； 若培养液中没有报告基因表达，则待测样品中不含有或候选不含有酰基高丝氨酸内 酯。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述培养的时间至少为2小时。
【文档编号】C12N15/78GK106085939SQ201610460794
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】庄国强, 程菲菲, 马安周
【申请人】中国科学院生态环境研究中心