一种猪链球菌2型10基因缺失株及应用
【专利摘要】本发明公开了一种猪链球菌2型10基因缺失株及应用，该菌株是在猪链球菌2型强毒力菌株SC的基础上敲除10个基因得到的，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015800。该菌株毒力较亲本菌株显著降低，安全性高，且免疫原性高，注射、滴鼻和口服途径免疫均能够保护免疫小鼠抵抗猪链球菌2型强毒力菌株的攻击，说明本疫苗可有效激活宿主的粘膜免疫系统和系统性免疫；同时，对不同ST型的猪链球菌2型强毒力菌株也具有交叉保护力。该疫苗制备方式简单，适合工业化生产。同时，由于该突变株的免疫原性与野生强毒株相似，因此可以作为标准品或全菌抗原应用到快速试剂盒的研制中。CCTCC NO：M201580020151229
【专利说明】
一种猪链球菌2型10基因缺失株及应用
技术领域
[0001] 本发明属于家畜传染病基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种猪链球菌2型10基 因缺失株及应用。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，链球菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧，在血 平板上可以产生α或β溶血，该菌能够生成荚膜，根据其荚膜抗原的不同，可以分为33个血清 型（1-31,33，1/2型）。而根据7个管家基因（aroA，cpn60，dpr，gki，mutS，recA, thrA)序列的 差异，可以将其分为不同的基因型（ST型），目前，全世界已经发现了至少704种不同ST型的 猪链球菌，众多的ST型要求猪链球菌疫苗具有交叉保护力。
[0003] 1954年，猪链球菌首次作为一种病原菌被报道，其天然宿主是猪，猪链球菌在猪群 中的感染以血清2型为主，其次是血清9型和3型。猪感染猪链球菌会导致猪链球菌病，其症 状有脑膜炎，败血症，关节炎，心内膜炎等，猪链球菌病给畜牧业的发展造成了严重的损失。
[0004] 与此同时，猪链球菌作为一种重要的人畜共患病原菌，不仅会造成猪的感染，也会 导致人的发病，目前全世界报道的人感染猪链球菌的案例已经到达1600多例。在人的感染 中，仍然以血清2型为主，其次是血清14型，而基因型则以ST1为主（图1)。猪链球菌感染人的 案例已经覆盖加拿大、美国、阿根廷、法属圭亚那、法国、德国、意大利、荷兰、西班牙、英国、 中国、柬埔寨、日本、泰国、越南等15个国家和地区，其中以亚洲最为严重。
[0005] 中国作为畜牧业大国，养猪产业发达，从事与猪养殖及相关产品加工的工作人员 众多，因此，猪链球菌感染的后果也就更加严重。在1998年和2005年，我国的江苏省和四川 省爆发了两次大规模的猪链球菌感染人的疫情，在这两次大爆发中，共有229人发病，52人 死亡。同时，在这两次疫情中，感染者出现了罕见的中毒样休克综合征。除此之外，猪链球菌 感染人的病例报道已经覆盖河南，湖北，江西，安徽，广东，广西，云南，香港，台湾等大部分 中南部省份，形势十分严峻。与其他国家和地区不同的是，在中国，尽管猪链球菌的感染也 是以血清2型为主，但是基因型却以ST7为主（图2)。
[0006] 猪链球菌感染范围之所以如此广泛，与它的感染方式不无关系。长久以来，猪链球 菌作为一种能导致系统性感染病原菌，人们普遍认为其感染模式如下:环境中的猪链球菌 会在一定条件下寄居在猪的扁桃体，这个过程并不一定导致发病，但是在一定条件下，扁桃 体内的猪链球菌会进入血液，进而导致猪发病；而感染人则主要通过伤口直接进入血液 (Gottsch alk and Segura,2000)。而近几年来，随着研究的深入，人们对于猪链球菌的感 染途径提出了新的见解，认为猪链球菌不仅有图所示的经扁桃体进入血液，还可以通过粘 膜尤其是胃肠道粘膜进入血液。其实早在2001年，有研究发现6份病人的直肠拭子为猪链球 菌阳性，调查发现患者均曾摄取生猪肉，暗示了猪链球菌从胃肠道感染途径的存在 (Goyette-Desjardins G，2014) ;2004年荷兰科学家则发现猪链球菌可以在猪受到一定压 力的条件下通过肠道进行感染(Bas SwildenS，2004)，但此后关于猪链球菌通过肠道致病 的研究进展缓慢，导致人们一定程度上忽略了猪链球菌的粘膜感染途径。近几年，日本一项 研究表明，酒精可以促进猪链球菌通过肠道进行感染(τ. Nakayama，2013);荷兰的研究团队 发现通过口服猪链球菌之后，猪出现临床症状，随后，该团队应用人结肠腺癌细胞Caco-2和 猪小肠上皮细胞IPEC-J2,系统验证了不同血清型和基因型的猪链球菌对这两种细胞的粘 附入侵和穿透能力，同时发现猪链球菌可以破坏这两种细胞的紧密连接，首次从细胞和分 子水平揭示了猪链球菌对于人的肠道致病机制(Maria Laura Ferrando，2014)。2014年，牛 津大学临床研究中心的一项评估报告指出，最易感染猪链球菌的人有两类，第一类是从事 与生猪养殖，猪肉产品加工生产有关的职业人群，第二类是吃过被猪链球菌污染的食物的 人群，两类人群的感染风险分别是38.1%和37.3%，（Vu Thi Lan Huong，2014)。同年，该研 究中心发现，越南人喝猪血的习惯与猪链球菌感染存在很大相关性(Vu Thi Lan Huong， 2014)。同时，也有研究在夏威夷和西班牙分别发现了由于食用了猪链球菌污染的食物而导 致人感染的案例（Suwarat Wongjittraporn MD，2014;L0pez_Mestanza 0,2016)。2016年3 月，Maria Laura Ferrando和Constance Schultsz提出了猪链球菌与宿主胃肠道互作的分 子模型，并且正式提出猪链球菌应该被评估为一种食源性疾病(Maria Laura Ferrando， 2016)。此外，目前多份临床数据显示猪群的扁桃体中猪链球菌阳性率达到100%，从病猪的 肺部和扁桃体分离到猪链球菌。综上所述，猪链球菌可通过粘膜系统感染宿主或者通过某 些机制暂时寄存于粘膜免疫组织(扁桃体），因此有效激活粘膜免疫系统在预防猪链球菌感 染和降低宿主的阳性携带率等方面发挥重要作用。目前已有的多份疫苗研究和专利成果均 通过注射实现免疫，而通过注射途径进行免疫的方式在激活粘膜免疫系统具有一定的局限 性，甚至不能有效激活粘膜免疫系统，因此亟需开发一种能有效激活粘膜免疫系统和系统 免疫的疫苗。
[0007] 鉴于猪链球菌基因型的多样性和致病途径的复杂性，对于猪链球菌疫苗的研制就 不能仅限于以往的注射疫苗，也需要同时开发能够激发多个部位免疫反应的口服疫苗，这 种新型的猪链球菌口服疫苗应该不仅能够通过注射起作用，更能够通过口服起作用，并且 具有一定的交叉保护力，能抵御不同ST型强毒力菌株的攻击。唯有如此，才能抵御猪链球菌 通过血液和粘膜系统等途径的感染。
【发明内容】
[0008] 为了解决猪链球菌疫苗的需求，本发明构建了 一株猪链球菌2型10基因缺失株，命 名为LSM110D10,是在猪链球菌2型强毒力分离株SC的基础上，利用同源重组技术，依次敲除 Sly、ScpA、SsnA、Fhb、SsadS、IgAl、Nudp、Ide Ssuis、endA、Mrp等 10个基因而获得低毒力，高 安全性、免疫原性好，高保护力，可以通过口服等多种途径免疫，且具备交叉保护力的菌株。 该菌株已于2015年12月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌 (Streptococcus suis)LSM110D10,保藏编号：CCTCC N0:M2015800,地址：中国武汉武汉大 学。
[0009] 本发明第二个目的是在于提供了一种猪链球菌2型10基因缺失株在制备治疗或预 防猪链球菌2型感染药物中的应用，用该菌株制备的疫苗免疫小鼠后，注射、滴鼻和口服均 具备显著的保护力，用以抵御同基因型的强毒力菌株SC19及异基因型的强毒力菌株LSM102 (本发明或称ST658)的感染。
[0010]本发明第三个目的在于为快速检测猪链球菌的提供标准品。目前已有的猪链球菌 酶联免疫吸附试剂盒主要以灭活菌体或者荚膜多糖作为包被抗原，通过检测疑似感染动物 的血清中猪链球菌抗体含量，来判断动物是否曾经感染猪链球菌。本发明的10基因缺失突 变株不影响猪链球菌荚膜多糖的合成，保持了很高的免疫原性，可以作为标准品应用到快 速检测试剂盒的生产中。
[0011] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
[0012] -种猪链球菌2型10基因缺失株通过下述方法制备得到：
[0013] 1)设计引物分别扩增猪链球菌2型强毒力分离株SC(发明人自行分离）的Sly、 3〇卩厶、581^、？1113、383(13、]^六1、仙(^、1(16 3811丨8、611(^、]\1印10个基因的上下同源臂，分别将其 连接到自杀性质粒pSET4s上构建重组穿梭质粒。
[0014] 2)将连接有目的基因上下同源臂的重组质粒电转化到猪链球菌2型强毒力分离株 SC中，利用温度与反向筛选标记进行筛选，获得猪链球菌2型单基因缺失株。
[0015] 3)再通过电转的方法，向已获得的猪链球菌2型单基因缺失株中转入连接有第二 个基因上下同源臂的重组质粒。同样利用温度与反向筛选标记筛选，获得猪链球菌2型双基 因缺失株。
[0016] 4)如步骤(2)、（3)所述，再依次缺失剩余基因，直到获得猪链球菌2型Δ Sly Δ ScpA Δ SsnA Δ Fhb Δ SsadS Δ IgAl Δ Nudp Δ Ide Ssuis Δ endA Δ MrplO基因缺失株LSM110D10。该 菌株已于2015年12月29日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌 (Streptoco ecus suis)LSM110D10,保藏编号：CCTCC N0:M2015800,地址：中国武汉武汉大 学。
[0017] LSM110D10在基本生物学特性上与猪链球菌2型一致。
[0018] LSM110D10在制备治疗或预防猪链球菌2型感染药物中的应用，包括利用 LSM110D10制备成活疫苗或灭活疫苗，用于口服、滴鼻或是注射，均可达到治疗或预防猪链 球菌2型感染的作用。
[0019] 与现有技术相比，本发明的效果和优点如下：
[0020] 由于LSM110D10毒力显著下降，可以作为减毒活疫苗使用，不需要灭活，避免了灭 活过程中带来的免疫原性损伤;作为减毒活疫苗，不需要依赖佐剂便可以起到很好的免疫 效果，节约了成本，也避免了佐剂使用带来一定的副作用。同时，用LSM110D10制备的减毒活 疫苗，既可以通过注射途径也可以通过口服途径进行免疫，且均具有交叉保护力。由于 LSM110D10的荚膜多糖抗原得以完整保存的优点，使其依然可以作为传统灭活疫苗使用，避 免由于灭活不彻底而导致的疫苗风险。
[0021 ]本发明中的LSM110D10是在猪链球菌2型强毒力株SC的基础上构建的猪链球菌2型 10基因缺失菌株，毒力大幅度下降，安全性高，不含有抗性筛选标记且遗传稳定，不存在毒 力返强的风险。LSM110D10形成荚膜多糖的能力正常，将该菌株制成减毒活疫苗后，免疫原 性高，能够保护免疫小鼠抵抗猪链球菌2型强毒菌株的攻击，同时，LSM110D10制备的减毒活 疫苗，可以通过口服途径免疫激活粘膜免疫系统，并且依然保持了较高的免疫原性。此外， 由于猪链球菌有众多ST型，LSM110D10制备的减毒活疫苗可以保护小鼠抵御不同ST型强毒 力菌株的攻击，具有交叉保护力，为有效控制我国猪链球菌病的发生与流行提供了有效的 防治工具。
【附图说明】
[0022] 图1为世界范围内感染人的猪链球菌ST型的关系图。
[0023] 圆点大小表示案例的多少，由图可知，世界范围内感染人仍以ST1为核心，ST7数量 最多，且与ST1亲缘关系很近，都属于CC1克隆群，此外，ST658也属于CC1克隆群，以上ST型均 是世界感染人的主流ST型。
[0024]图2是中国境内所有已报道的及猪源猪链球菌ST型分布示意图。
[0025] 由图可知，在中国，ST7属于核心位置，且数量最多，而本实验所用的亲本菌株SC便 是ST7菌株，同时，ST658与其亲缘关系较近，属于感染的核心菌株，本发明所构建的疫苗对 ST658具有交叉保护力，具有较大的现实意义。
[0026] 图3是猪链球菌由环境进入机体致病的示意图。
[0027] 长久以来，人们倾向于认为环境中的猪链球菌进入猪体内寄居在扁桃体，在一定 条件下通过扁桃体进入血液致病，也可以通过伤口感染直接致病，感染人主要是通过后一 种方式。随着研究的深入，现在人们又发现了猪链球菌进入机体的另外一条途径，便是通过 胃肠道粘膜致病，这两条途径的发现预示着猪链球菌疫苗应该具备口服免疫的功效以抵御 食源性感染。
[0028] 图4为pSET4s载体图谱。
[0029]该质粒具有在革兰氏阴性菌中起作用的复制起点ColElori和在革兰氏阳性菌中 起作用的复制起点orfC，前者用于质粒的构建和克隆，后者用于筛选缺失株。同时载体具有 壮观霉素抗性，可作为筛选标记。
[0030] 图5为本发明的猪链球菌2型10基因缺失株LSM110D10的PCR鉴定结果示意图。
[0031] 图5A中，M1:DNA 11^11?^(01^15000);]\12:0祖1^11?^(01^2000);泳道1、3，用517基因 的外部引物对进行扩增;泳道2、4,用Sly基因的内部引物对进行扩增;泳道5、7,用ScpA基因 的外部引物对进行扩增;泳道6、8,用ScpA基因的内部引物对进行扩增;泳道9、11，用SsnA基 因的外部引物对进行扩增;泳道1〇、12,用SsnA基因的内部引物对进行扩增;泳道13、15,用 Fhb基因的外部引物对进行扩增；泳道14、16,用Fhb基因的内部引物对进行扩增；泳道17、 19,用SsadS基因的外部引物对进行扩增;泳道18、20,用SsadS基因的内部引物对进行扩增； 泳道1、2、5、6、9、10、13、14、17、18模板为猪链球菌2型强毒力分离株3(： ;泳道3、4、7、8、11、 12、15、16、19、20模板为10基因缺失株1^]\1110010。图58中，]\11 :0财11^11?^(01^15000);]\12: DNAmarker (DL2000);泳道1、3，用IgAl基因的外部引物对进行扩增;泳道2、4，用IgA 1基因的 内部引物对进行扩增；泳道5、7,用Nudp基因的外部引物对进行扩增；泳道6、8,用Nudp基因 的内部引物对进行扩增;泳道9、11，用Ide Ssuis基因的外部引物对进行扩增;泳道10、12， 用Ide Ssuis基因的内部引物对进行扩增;泳道13、15,用endA基因的外部引物对进行扩增； 泳道14、16,用endA基因的内部引物对进行扩增;泳道17、19,用Mrp基因的外部引物对进行 扩增;泳道18、20，用Mrp基因的内部引物对进行扩增;泳道1、2、5、6、9、10、13、14、17、18模板 为猪链球菌2型强毒力分离株SC;泳道3、4、7、8、11、12、15、16、19、20模板为10基因缺失株 LSM110D10。图5A和图5B表明10基因缺失株LSM110D10构建成功。
[0032] 图6A为透射电镜下猪链球菌2型SC菌株示意图。
[0033]图6B为本发明的10基因缺失株LSM110D10的形态结构图。
[0034]由图可知LSM110D10的产生荚膜能力并没有发生变化，这是其具有较高的免疫原 性的结构基础。
[0035]图7是猪链球菌2型SC菌株和本发明的10基因缺失株LSM110D10的耐药性测定结果 示意图。
[0036]由图可知两个菌株最小抑菌浓度均为0.16,表明LSM110D10的耐药性没有发生变 化，可以作为其细胞壁没有发生变化的一个证据，也是LSM110D10具有较高免疫原性的结构 基础。
[0037]图8为本发明的猪链球菌2型10基因缺失株LSM110D10与猪链球菌2型强毒力菌株 SC的生长曲线示意图。
[0038]以实验室构建的一个8基因缺失株作为对照，由图可知，经过14个小时的测定，三 株菌的生长0D值均可以达到1.0左右，并且基本稳定，且曲线基本一致，LSM110D10生长与亲 本菌株SC相比无明显差异。表3为图8的数据统计。
[0039]图9是本发明的LSM110D10与猪链球菌2型强毒力菌株SC的溶血活性测定结果示意 图。
[0040] 以未敲除溶血素基因 Sly的一个3缺失突变株作为对照，由图可知，SC与3缺失0D值 可以达到0.9左右，而LSM110D10与空白对照组的0D值均在0.1左右，表明LSM110D10的溶血 活性与SC相比显著下降。
[0041] 图10是本发明的LSM110D10与猪链球菌2型强毒力菌株SC的小鼠攻毒实验结果示 意图。
[0042] SC攻毒后小鼠第一天便全部死亡，致死率100%，而LSM110D10攻毒后小鼠两周后 仍全部存活，致死率为0,表明LSM110D10毒力与SC相比显著下降。表4为图10的数据统计。 [0043]图11是本发明的LSM110D10与猪链球菌2型强毒力菌株SC的猪全血杀菌实验结果 示意图。
[0044]由图可知在2个小时之内，SC呈指数增长，而LSM110D10呈负增长，到3个小时增长 也受到明显抑制，3小时，SC增长了约30倍，而LSM110D10基本没有增长，表明LSM110D10与SC 相比，在血液中的存活能力显著下降，这也说明在猪模型中，LSM110D10的毒力与SC相比显 著下降。
[0045]图12为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，再以SC19 强毒力菌株腹腔攻毒时实验结果示意图。
[0046] 未免疫组小鼠死亡率达到90 %，而皮下、滴鼻或灌胃三个免疫组小鼠存活率分别 为80%，60%，70%显著高于未免疫组，表明经过三种方式免疫后，LSM110D10均可提供较高 的保护力以抵御SC19强毒力菌株攻击。表5为图12的数据统计。
[0047]图13为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，采集小鼠 全血，做SC19强毒力菌株全血杀菌结果示意图。
[0048] 未免疫组增长率约为100%，与未免疫组小鼠相比，经三种方式免疫后的小鼠全血 中，SC19增长率分别约为5%，30%，10%，表明免疫后的全血均具有显著的杀菌能力。
[0049]图14为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，再以 LSM102(ST658)强毒力菌株腹腔攻毒时实验结果示意图。
[0050] 未免疫组小鼠死亡率达到90%，而免疫组小鼠存活率分别为70%，50%，60%，显 著高于未免疫组，表明经过三种方式免疫后，LSM110D10均可提供较高的交叉保护力以抵御 ST658型强毒力菌株LSM102的攻击。表6为图14的数据统计。
[0051]图15为本发明的LSM110D10以皮下、滴鼻或灌胃三种方式分别免疫小鼠之后，采集 小鼠全血，做ST658型强毒力菌株LSM102的全血杀菌结果示意图。
[0052] 未免疫组增长率约为100%，与未免疫组小鼠相比，经三种方式免疫后的小鼠全血 中，LSM102增长率约为10%，20%，12%，表明免疫后小鼠全血均具有显著的杀菌能力，显示 出疫苗具备交叉保护力。
[0053]图16为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，以滴鼻的 方式攻毒SC19强毒力菌株后，小鼠组织载菌量实验结果示意图。
[0054]图16六，168，16(：，160分别是取小鼠血、肺、脑、肝所做组织载菌量，由图可知，经三 种方式免疫本发明的LSM110D10后，相对于未免疫组，皮下、滴鼻或灌胃三种免疫方式免疫 后，小鼠血、肺、脑、肝四个组织中的菌量分别下降了约10倍，10倍，1000倍，10倍。表明小鼠 对于通过鼻腔及呼吸道粘膜入侵的SC19强毒力菌株具有显著的清除能力。
[0055]图17为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，以灌胃的 方式攻毒SC19强毒力菌株后，小鼠组织载菌量的实验结果示意图。
[0056]图17A，17B，17C，17D分别是取小鼠血、肺、脑、肝所做组织载菌量，由图可知，经三 种方式免疫本发明的LSM110D10后，相对于未免疫组，皮下、滴鼻或灌胃三种免疫方式分别 免疫后，小鼠血、肺、脑、肝四个组织中的菌量分别下降了约100倍，10倍，100倍，10倍。表明 小鼠对于通过胃肠道粘膜入侵的SC19强毒力菌株具有显著的清除能力。
【具体实施方式】
[0057]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，本发明实施例所述技术方案，如未 特别说明，均为本领域的常规技术;所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。 [0058] 实施例1:
[0059] 猪链球菌10基因缺失株LSM110D10的获得：
[0060] 根据GenBank上公布的猪链球菌2型05ZYH33株全基因组GB|CP000407.1 |设计引 物，从猪链球菌2型野生菌SC基因组中扩增待缺失基因的上游同源臂和下游同源臂，构建敲 除载体，用于目的基因的敲除。
【申请人】构建和筛选缺失株是利用反向筛选标记通过重组质 粒与菌株基因组间的两步单交换同源重组的方法实现的。这种方法可以重复使用来构建多 基因突变株，且不会留下任何筛选标记，具体参见DaisukeTakamatsu博士的相关报道 (DaisukeTetal,2001，45:101-113)〇
[0061] 目的基因敲除后，设计位于基因两侧的引物对和位于基因内部的引物对，用于筛 选鉴定基因缺失突变株，鉴定结果见图5,相关的鉴定引物如下表所不：
[0062] 表1.各基因内部引物及目的片段长度
[0063]
[0065]表2.各基因外部引物及目的片段长度
[0066]
[0067] 该菌株已于2015年12月29日送至中
国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链 球菌（Streptococcus suis)LSM110D10，保藏编号：CCTCC NO:M2015800，地址：中国武汉武 汉大学。
[0068] 实施例2:
[0069] 猪链球菌10基因缺失株LSM110D10的特性：
[0070] 1)在电镜下观察猪链球菌2型强毒力菌株SC和猪链球菌10基因缺失株LSM110D10， 两者均形成了正常的细菌形态，细胞壁和荚膜，且两者形态并无显著差异，如图6。
[0071] 2)耐药性测定。将猪链球菌2型强毒力菌株SC和猪链球菌10基因缺失株LSM110D10 分别接种于5mL含有10 %新生牛血清的TSB培养基中培养，37 °C培养至对数期，调整浓度为 1.2 X 109 CFU/mL，取100yL均匀涂布于MH+10%羊血平板，贴上青霉素 E-test试纸条，小心 赶出气泡，37°C培养24h后读数，结果如图7,图7是猪链球菌2型SC菌株和本发明的10基因缺 失株LSM110D10的耐药性测定结果，由图可知两个菌株最小抑菌浓度均为0.16,表明 LSM110D10的耐药性没有发生变化，可以作为其细胞壁没有发生变化的一个证据，也是 LSM110D10具有较高免疫原性的结构基础。
[0072] 3)生长曲线测定。将猪链球菌2型强毒力菌株SC和猪链球菌10基因缺失株 LSM110D10分别接种于5mL含有10%新生牛血清的TSB培养基中培养，37°C培养，并于培养后 每间隔一小时分别取l〇〇yL菌液测定OD600值，绘制生长曲线，结果如图8,图8为本发明的猪 链球菌2型10基因缺失株LSMIIODIO(IOA)与猪链球菌2型强毒力菌株SC的生长曲线示意 图，且以实验室构建的一个8基因缺失株8Λ作为对照，由图可知，经过14个小时的测定，三 株菌的生长0D值均可以达到1.0左右，并且基本稳定，且曲线基本一致，LSM110D10生长与亲 本菌株相比无明显差异。表3为图8的数据统计。
[0073] 表 3
[0074]
[0075] 实施例3:
[0076] 猪链球菌10基因缺失株LSM110D10的安全性：
[0077] 1)溶血活性测定。将菌株接种于5mL含有10%新生牛血清的TSB培养基中培养至对 数期，调整浓度至5 X 107CFU/mL，取100yL加入到900yL 5%的新鲜绵羊红细胞中，阴性对照 组加100yL PBS缓冲液，37°C培养2h，离心取上清，570nm下测定吸光值，结果如图9，图9是本 发明的LSM110D10与猪链球菌2型强毒力菌株SC的溶血活性测定结果，以未敲除溶血素基因 Sly的一个3缺失突变株作为对照，由图9可知，SC与3缺失0D值可以达到0.9左右，而 LSM110D10与空白对照组的0D值均在0.1左右，表明LSM110D10的溶血活性与SC相比显著下 降。
[0078] 2)小鼠攻毒实验。猪链球菌2型强毒力菌株SC和猪链球菌10基因缺失株LSM110D10 培养至对数期，调整浓度至2 X 109CFU/mL，取200yL腹腔注射Balb/c雌性6周龄小鼠，每组10 只小鼠，观察小鼠症状，统计死亡数，结果如图10,图10是本发明的LSM110D10与猪链球菌2 型强毒力菌株SC的小鼠攻毒实验，SC攻毒后小鼠第一天便全部死亡，致死率100 %，而 LSM110D10攻毒后小鼠两周后仍全部存活，致死率为0,表明LSM110D10毒力与SC相比显著下 降。表4为图10的数据统计。
[0079] 表 4
[0080]
[0081 ] 3)猪血全血杀菌。猪链球菌2型强毒力菌株SC和猪链球菌10基因缺失株LSM110D10 培养至对数期，调整浓度至5 X 104CFU/mL，取50yL菌液与450yL猪新鲜血液混合，缓慢转动， 置于37°C条件下培养。分别于〇11^11、6〇1^11、12〇1^11、18〇1^11取10(^1^适当稀释后涂平板计数。 结果如图11。图11是本发明的LSM110D10与猪链球菌2型强毒力菌株SC的猪全血杀菌实验， 由图可知在2个小时之内，SC呈指数增长，而LSM110D10呈负增长，到3个小时增长也受到明 显抑制，3小时，SC增长了约30倍，而LSM110D10基本没有增长，表明LSM110D10与SC相比，在 血液中的存活能力显著下降，这也说明在猪模型中，LSM110D10的毒力与SC相比显著下降。 [0082] 实施例4:
[0083] 猪链球菌10基因缺失株LSM110D10的保护性：
[0084] 1)免疫。猪链球菌10基因缺失株LSM110D10培养至对数期，PBS调整浓度，小鼠分为 3组，分别采用皮下多点注射，滴鼻，灌胃3种方式进行免疫，每组30只小鼠 Balb/c雌性4周龄 小鼠。皮下免疫200yL，浓度为1 X 107CFU/mL;滴鼻免疫20yL，浓度为1 X 108CFU/mL;灌胃免疫 l〇〇yL，浓度为1Χ1080Ρυ/πιΙ^14天后加强免疫，方法同一免，对照组不做处理。
[0085] 2)对SC19的保护力检验。二免14天后，将各免疫组及对照组小鼠再分别分为3组， 分别以猪链球菌2型强毒力菌株SC19(Li W，Liu L，Qiu D，Chen H and Zhou R.Identification of Streptococcus suis serotype 2 genes preferential expressed in the natural host. Int JM ed Microb，2010,300:482-488)进行腹腔，滴 鼻，灌胃攻毒。各个免疫组包括对照组均取10只小鼠，腹腔攻毒200yL，浓度为2.5 X 109CFU/ mL。各个免疫组包括对照组均取5只小鼠，滴鼻攻毒20yL，浓度为5 X 109CFU/mL。各个免疫组 包括对照组均取5只小鼠，灌胃攻毒100yL，浓度为1 X 109CFU/mL。观察腹腔攻毒的小鼠临床 症状，并统计死亡数，滴鼻和灌胃攻毒小鼠，于24h取血，肺，脑，肝，做组织载菌量。相关结果 见图12,图16和图17。图12为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之 后，再以SC19强毒力菌株腹腔攻毒时实验结果，未免疫组小鼠死亡率达到90%，而皮下、滴 鼻、灌胃三个免疫组小鼠存活率分别为80%，60%，70%显著高于未免疫组，表明经过三种 方式免疫后，LSM110D10均可提供较高的保护力以抵御SC19强毒力菌株攻击。表5为图12的 数据统计。
[0086] 表 5
[0087]
[0088]图16为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，以滴鼻的 方式攻毒SC19强毒力菌株，然后做组织载菌量实验结果。
[0089]图16A，16B，16C，16D分别是取小鼠血肺脑肝所做组织载菌量，由图可知，经三种方 式免疫本发明的LSM110D10后，相对于未免疫组，皮下滴鼻灌胃三种免疫方式免疫后，小鼠 血肺脑肝四个组织中的菌量分别下降了约10倍，10倍，1000倍，10倍。表明小鼠对于通过鼻 腔及呼吸道粘膜入侵的SC19强毒力菌株具有显著的清除能力。
[0090] 图17为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，以灌胃的 方式攻毒SC19强毒力菌株，然后做组织载菌量实验结果。
[0091] 图17A，17B，17C，17D分别是取小鼠血、肺、脑、肝所做组织载菌量，由图可知，经三 种方式免疫本发明的LSM110D10后，相对于未免疫组，皮下滴鼻灌胃三种免疫方式免疫后， 小鼠血肺脑肝四个组织中的菌量分别下降了约100倍，10倍，100倍，10倍。表明小鼠对于通 过胃肠道粘膜入侵的SC19强毒力菌株具有显著的清除能力。
[0092] 3)对 ST658 型强毒力菌株 LSM102(MLST 数据库，http: //ssuis .mist · net)的交叉保 护力检验。二免14天后，对各免疫组及对照组小鼠各组10只，用ST658型强毒力菌株LSM102 进行腹腔攻毒。腹腔攻毒200yL，浓度为2.5 X 109CFU/mL，观察小鼠临床症状，并统计死亡 数。相关结果见图14。图14为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之 后，再以LSM102(ST658)强毒力菌株腹腔攻毒时实验结果，未免疫组小鼠死亡率达到90%， 而免疫组小鼠存活率分别为70%，50%，60%，显著高于未免疫组，表明经过三种方式免疫 后，LSM110D10均可提供较高的交叉保护力以抵御ST658型强毒力菌株LSM102的攻击。表6为 图14的数据统计。
[0093] 表 6
[0094]
[0095] 因为世界范围内猪链球菌感染仍以ST1为核心，ST7数量最多，且与ST1亲缘关系很 近，都属于CC1克隆群，ST658也属于CC1克隆群，ST658与主流菌株亲缘关系较近，属于感染 的核心菌株，本发明所构建的疫苗对ST658具有交叉保护力，具有较大的现实意义。
[0096] 4)免疫后小鼠全血杀菌能力。二免14天后，采集免疫组及未免疫组小鼠全血。猪链 球菌2型强毒力菌株SC19和ST658型强毒力菌株LSM102培养至对数期，调整浓度至5X 104CFU/mL，取50yL菌液分别与450yL小鼠（皮下免疫，滴鼻免疫，灌胃免疫，对照组4组）的新 鲜血液混合，缓慢转动，置于37°C条件下培养。于120min取100yL适当稀释后涂平板计数。相 关结果见图13和图15。图13为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之 后，采集小鼠全血，做SC19强毒力菌株全血杀菌，未免疫组增长率约为100%，与未免疫组小 鼠相比，经三种方式免疫后的小鼠全血中，SC 19增长率分别约为5 %，30 %，10 %，表明免疫 后的全血均具有显著的杀菌能力。
[0097]图15为本发明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三种方式免疫小鼠之后，采集小鼠 全血，做ST658型强毒力菌株LSM102的全血杀菌，未免疫组增长率约为100%，与未免疫组小 鼠相比，经三种方式免疫后的小鼠全血中，LSM102增长率约为10%，20%，12%，表明免疫后 小鼠全血均具有显著的杀菌能力，显示出疫苗具备交叉保护力。
【主权项】
1. 一种猪链球菌2型10基因缺失株，其特征在于：猪链球菌（?SirejOiococcus suis) LSM110D10,保藏编号为：CCTCC NO: Μ 2015800。2. 权利要求1所述的猪链球菌2型10基因缺失株在制备治疗或预防猪链球菌2型感染药 物中的应用。3. 权利要求1所述的猪链球菌2型10基因缺失株在制备猪链球菌检测的全菌标准品中 的应用。
【文档编号】A61K39/09GK106085936SQ201610422135
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610422135.6, CN 106085936 A, CN 106085936A, CN 201610422135, CN-A-106085936, CN106085936 A, CN106085936A, CN201610422135, CN201610422135.6
【发明人】李锦铨, 周洋, 王小红, 李志伟, 林蠡, 董星星
【申请人】华中农业大学