一种筛选人类egfr基因多态性的引物组、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及由等位基因特异性扩增(ASA)、重组酶聚合酶扩增 (RPA)、肽核酸(PNA)结合DNA技术以及SYBR GreenI显色组合而成的一种快速且准确筛选人 类EGFR基因多态性(单个核苷酸多态性和基因缺失）的新方法。
【背景技术】
[0002] 快速、准确并且简便的基因多态性筛查方法一直受到广泛的重视。人类基因组是 一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因 分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物 种的共同性和稳定性，也决定了目前基因组测定是有意义的，即有代表性的。
[0003] 然而人类基因组又是一个变异的体系。在长期进化的过程中，基因组的DNA序列不 断地发生变异。这些变异可能是有害的、有益的或中性的，它们其中的一些被保存下来，导 致了不同种族、群体和个体间基因组的差异或多态性。除了同卵双生子外，没有两个个体的 基因组是完全相同的。
[0004] 表皮生长因子受体(EGFR)的基因多态性通常是发生在19号染色体缺失（E746-A750)和21号染色体L858R点突变(最普遍的单个核苷酸多态性），到目前为止，基于聚合酶 链反应(PCR)扩增DNA的测序技术已成为一个标准技术，然而，由于该标准技术需要大型的 设备和复杂的实验步骤，包括热循环设备和DNA测序设备等，目前的分子筛选方法仍然大大 阻碍该基因多态性检测的效果。
[0005] 目前，等温酶扩增DNA系统包括基于核酸序列的扩增，环介导等温扩增（LAMP)，滚 环扩增和解旋酶依赖性扩增。最近，智能扩增方法(SMAP)被开发用于筛选EGFR多态性，但其 复杂的引物设计，大型设备和对操作人员的专业性高要求是其操作缺点。与此相反，重组酶 聚合酶扩增(RPA)是一种较为先进的DNA扩增方法，反应温度为37°C，引物设计简便，并具有 更快的扩增速度，能得到大量产物。此外，通过ATP水解作用来促进链置换扩增使基因扩增 方法变得更为有趣和实用。RPA可以适用于扩增不同的DNA和RNA，随着等温扩增核酸新技术 的逐渐产生，重组酶聚合酶扩增以其极快的扩增速度备受瞩目。
[0006] 重组酶聚合酶扩增(RPA)最突出的特点是利用重组酶与引物寡DNA的结合，寻找到 目的序列，在单链结合等蛋白作用下低温（36-40°C)打开双链DNA，具有高特异性、高敏感 性，能够快速产出目的DNA片段。遗憾的是，RPA扩增方法还没有被用于快速筛选人类基因 多态性。并且，在单个核苷酸多态性的筛选中更是需要大型、精密的仪器或者高端科学及人 才。目前基因多态性的筛选都还停留在以实时定量PCR为基础的方法中，而且并不能普及。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种实用可靠的筛选基因多态性的引物 组、其试剂盒及其检测方法，本发明在特异性、敏感性、简便性和即时筛选等方面都具有很 大优势。本发明是基于等位基因特异性扩增(ASA)，重组酶聚合酶扩增(RPA)，肽核酸(PNA)， 和SYBR Green I染料，即AS-RPA-PNA-SYBR(ARPS)系统的基因筛选新方法，目的是识别EGFR 基因多态性，这可用于对EGFR多态性的筛选。该系统中的ASA/AS理论，RPA扩增，PNA和SYBR Green的结合，不需要任何大型设备，或侧流筛选试纸等的精密试剂。只需要用本试剂盒中 已设计好的引物组和扩增缓冲液，即可进行筛选检测。预计这种方法将是未来筛选基因多 态性，与基因筛查发展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速筛选方法。
[0008] 本发明组合运用了等位基因特异性扩增(ASA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、肽核酸 (PNA)结合DNA和SYBR GreenI显色四种分子生物学方法。以EGFR多态性为筛选对象，进行基 因多态性筛选方法的研究。
[0009] 在本发明的引物筛选方面，重组酶聚合酶扩增引物的设计要求是
[0010] (1)引物长度在30-40个碱基内
[0011] (2)扩增片段长度最好在150-300个碱基内
[0012] (3)引物的3'端避开第三位密码子(正向和反向引物最好都避免）
[0013] (4)PNA的设计以PNA与非靶序列结合的Tm值(熔解温度，主要由PNA的长度和碱基 序列决定)和设计的PNA片段的特异性(不与其他序列结合)为标准。
[0014] 根据上述筛选标准，本发明所述的筛选人类EGFR基因多态性的引物组，其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1~2或者SEQ ID N0.3~5所示。
[0015] 本发明还设计一种筛选人类EGFR基因多态性的试剂盒，其包括上文所述的引物组 之外，还包括检测试剂，即：核苷酸序列为SEQ ID NO. 1~2和/或者SEQ ID N0.3~5所示的 引物，重泡胀缓冲液、醋酸镁溶液、SYBR GreenI溶液及含有冻干扩增酶的EP管。
[0016] 此外，在上文所述的试剂盒中，还可以包括记载检测待测样品方法的说明书。
[0017] 同时，上文所述的试剂盒中，还可以包括阳性质控DNA:浓度为150ng/2yL的HCC-827细胞系DNA;阴性质控DNA:浓度为150ng/2yL的A549细胞系DNA。
[0018] 在检测筛选15个碱基缺失的EGFR19Del(2)多态性中，不需要利用PNA-DNA抑制背 景扩增，即只需要利用等位基因特异性重组酶扩增技术即可;在检测筛选单个核苷酸多态 性如EGFRL858R多态性中，由于重组酶扩增速度非常快，需要预先利用PNA与样本DNA中非点 多态性的片段结合，使其形成的PNA-DNA复合体在36-40°CRPA扩增中不会因为单链结合蛋 白等因素而分开，使聚合酶不能识别并打开PNA-DNA复合物以抑制非特异性扩增。而SYBR也 不能识别PNA，所以不必担心因为PNA而产生假阳性结果(应为阴性黄色结果而显绿色）。
[0019]利用上文所述的筛选人类EGFR基因（15个碱基缺失的EGFR19De 1⑵）多态性的引 物组SEQ ID NO. 1~2的检测方法，其操作步骤包括：
[0020] 将12yL双蒸水、2yL的浓度为10μΜ的正向引物SEQ ID N0.1、2yL的浓度为10μΜ的反 向引物SEQ ID N0.2、2yL的浓度为150ng/yL的样本DNA和29.5yL重泡胀缓冲液 (rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge，UK)的EP管中，混勾后 再向其中加入2.5yL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少5min，再按照每20yL产物应 用1 yL的比例，加入浓度为200X的SYBR Green I。优选的情况下，应用上述检测方法的时候， 除了样本DNA外，还可以包括对阳性质控DNA和阴性质控DNA的检测，且更为优选的扩增时间 为15min〇
[0021] 利用上文所述的筛选人类EGFR基因（EGFRL858R)多态性的引物组SEQ ID NO. 3~5 的检测方法，其操作步骤包括：
[0022] 将 10yL双蒸水、2yL的浓度为20μΜ的PNA SEQ ID Ν0.5、2μΙ^?度为 150ng/yL的样本 DNA，预先进行99°C解链2min，66°C结合2min，再加入2yL的浓度为ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID NO. 3、2yL的浓度为ΙΟμΜ的反向引物SEQ ID NO. 4，和29.5yL重泡胀缓冲液加入到含有冻干 扩增酶的E P管中，混匀后再向其中加入2.5 μ L浓度为2 8 0mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少 lOmin后获得扩增产物，再按照每20yL扩增产物应用lyL的比例，加入浓度为200X的SYBR GreenI〇
[0023] 优选的情况下，应用上述检测方法的时候，除了样本DNA外，还可以包括对阳性质 控DNA和阴性质控DNA的检测，且更为优选的扩增时间为15min。
[0024] 为了进一步验证采用SYBR GreenI显色结果是否准确，可以辅以琼脂糖凝胶电泳 检测的方法进行验证，即：将利用上述方法扩增15min后获得的扩增产物中取出30yL加入 100yL无水乙醇后12000rpm/min，离心5min，去除液体纯化RPA扩增产物(此步骤目的为去除 扩增缓冲液，便于琼脂糖凝胶电泳的检测）后，再加入30yL双蒸水，最后进行琼脂糖凝胶电 泳检测条带结果。
[0025]利用上文所述的试剂盒及试剂盒的使用方法筛选组织标本时。可以以阳性质控 DNA和阴性质控DNA为对照品，白色背景为筛选环境，筛选冰冻组织样本中基因多态性情况。 混匀SYBR显色剂之后，结果显示阳性质控DNA产生肉眼可见的绿色荧光并且阴性质控DNA显 示黄色，表明本实验结果可靠，样品DNA的阳性结果为肉眼可见的绿色荧光，阴性结果为不 变的黄色(不变色）。
[0026]本发明另一目的在于，利用上文所述的引物组在制备筛选人类EGFR基因多态性的 检测试剂中的应用。
[0027]有益效果
[0028]本发明方法利用RPA极为快速的扩增技术，并结合ASA特异性方法可在最短5min内 (样本中无干扰组织的理想情况下)筛选出EGFR19Del多态性。
[0029]本发明方法将PNA预先与模板DNA结合，然后利用RPA极为快速的扩增技术，并结合 ASA特异性扩增方法可在最短1 Omin内（样本中无干扰组织的理想情况下）筛选出EGFRL858R 点多态性。发现RPA主要扩增酶gp32和Bsu无法区别多态性与正常样本DNA(结果显色均为阳 性），但是扩增酶无法打开预先与非多态性DNA结合的PNA-DNA复合物，从而RPA扩增反应无 法扩