进行99°C解链2min， 66°CPNA-DNA结合2min，再加入2yL正向引物、2yL反向引物（引物浓度均为ΙΟμΜ)、和29.5yL 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge，UK)的 EP管中，混匀后再向其中加入2.5yL醋酸镁溶液(280mM)混匀、扩增，扩增15min后，将预先滴 在EP管盖内的2.5yL的SYBR混匀(每20yL产物加入lyLSYBR)，观察结果。
[0075] ARPS结果显示新鲜冰冻样本2(CaSe2)、3(CaSe3)、4( CaSe4)产生肉眼可见的绿色 荧光，并与PCR扩增后测序法结果相一致(多态性阳性）；样本5和6没有产生肉眼可见的绿色 荧光，新鲜冰冻样本经PCR扩增后测序结果也为多态性阴性。
[0076]图4A:显示检测筛选的临床样本中EGFR19Del(2)型多态性的情况。从上至下依次 阳性质控(HCC827细胞系DNA)、阴性质控(A549细胞系DNA)、一个阳性临床样本中（经过直接 测序法检测筛选验证过的19Del (2)多态性样本）、两个癌旁组织（经过测序法筛选了非 19Del多态性）。（左边为本发明检测筛选结果，右边为直接测序验证结果）
[0077]图4B:B:显示筛选的临床样本中EGFRL858R多态性的情况。从上至下依次为阳性质 控(H1975细胞系DNA)、阴性质控(A549细胞系DNA)、三个阳性临床样本(经过直接测序法筛 选验证过的L858R多态性）、两个癌旁组织(经过测序法筛选了非L858R多态性)样本。（左边 为本发明筛选结果，右边为直接测序验证结果）
[0078] 实施例5
[0079] 筛选点多态性时，未预先经过PNA与非目的条带结合（即99°C2min和66°C2min)的 筛选效果
[0080]为了验证是否有必要先使PNA与非目的序列结合，本发明在筛选EGFRL858R点多态 性时也验证了同时将10yL双蒸水、2yL的PNA、2yL正向引物、2yL反向引物、2yL样本DNA和 29.5yL重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX，Cambridge， UK)的无核酸及核酸酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5yL醋酸镁溶液（280mM)混匀、扩 增。扩增15min后，浓度为200X的SYBR GreenI(S〇larbi〇,北京，索莱宝科技有限公司）溶液 每20yL产物应用lyL，样本DNA的量为300ng(以上考虑到敏感性和特异性的平衡）。虽然又加 入了靶序列EGFR L858R的另一个错配碱基（图5,绿色字母）。琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果 也不甚理想。（即筛选点多态性时，必须先利用PNA与非目的序列结合，去除假阳性，图5)。
[0081] 图5.显示引物序列和琼脂糖凝胶电泳数据。A:筛选EGFR L858R的另一个错配碱基 在反向引物中的位置（绿色字母）』：琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果。目的片段长°C为 201bp，"+"表示从RPA反应试剂盒（143bp)的阳性对照。所使用的DNA量为300ng。
[0082] 以上内容是结合优选的技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明 的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发 明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。 序列表 < 110> -种筛选人类EGFR基因多态性的引物组、试剂盒及其检测方法 <120>大连医科大学附属第二医院 2015 <160> 5 <I70> Patentlti version <?. 10> 1 <211> 39 <212> DNA <213> ?Η向引物
[0083] <400> 1 gtgagaaagl laaaauccc glcgcialca agacalctc 3:9 <210> 2 <21 卜 36 <212> DMA <213>反向引物 <棚> 2 galaccagca igggagaggc caglgclgic tclaag 36 <210> 3 <211^ 31 212> DNA
[0084] <213? 正向引物 <400> 3 clgaallcgg algcagagcl tcUccxatg a 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213?反向引物 <400> 4 cUtclcUc cgcaccxagc agtllggcxc 30 <210 5 <211> 10 <212> DMA M FNA <400> 5 gccagcccaa 10
【主权项】
1. 一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1~2或者SEQ ID NO.3~5所示。2. -种筛选人类EGFR基因多态性的试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述的引物组 以及检测试剂：核苷酸序列为SEQ ID NO. 1~2和/或者SEQ ID NO.3~5所示的引物，重泡胀 缓冲液、醋酸镁溶液、SYBR Green I溶液及含有冻干扩增酶的EP管。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括记载检测待测样品方法的说明 书： 将12yL双蒸水、2yL的浓度为ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.1、2yL的浓度为ΙΟμΜ的反向引 物SEQ ID N0.2、2yL的浓度为150ngAiL的样本DNA和29.5yL重泡胀缓冲液加入到含有冻干 扩增酶的E P管中，混匀后再向其中加入2.5 μ L浓度为2 8 0mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少 5min，再按照每20yL产物应用lyL的比例，加入浓度为200X的SYBR Green 1〇4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括记载检测待测样品方法的说明 书： 将10yL双蒸水、2yL的浓度为20μΜ的PNA SEQ ID N0.5、2yU^度为150ng/yL的样本DNA， 预先进行99°C解链2min，66°C结合2min，再加入2yL的浓度为ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.3、 2yL的浓度为ΙΟμΜ的反向引物SEQ ID NO.4,和29.5yL重泡胀缓冲液加入到含有冻干扩增酶 的EP管中，混匀后再向其中加入2.5yL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少lOmin，再 按照每20yL产物应用lyL的比例，加入浓度为200X的SYBR Green I。5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于:所述说明书中还包括:取扩增产物30 yL加入100yL无水乙醇后，12000rpm/min离心5min，去除液体后再加入30yL双蒸水，最后进 行琼脂糖凝胶电泳检测。6. 利用权利要求1所述的引物组的筛选人类EGFR基因多态性的方法，其特征在于:操作 步骤包括： 将12yL双蒸水、2yL的浓度为ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.1、2yL的浓度为ΙΟμΜ的反向引 物SEQ ID N0.2、2yL的浓度为150ngAiL的样本DNA和29.5yL重泡胀缓冲液加入到含有冻干 扩增酶的E P管中，混匀后再向其中加入2.5 μ L浓度为2 8 0mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少 5min，再按照每20yL产物应用lyL的比例，加入浓度为200X的SYBR Green 1〇7. 利用权利要求1所述的引物组的筛选人类EGFR基因多态性的方法，其特征在于:操作 步骤包括： 将10yL双蒸水、2yL的浓度为20μΜ的PNA SEQ ID N0.5、2yU^度为150ng/yL的样本DNA， 预先进行99°C解链2min，66°C结合2min，再加入2yL的浓度为ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.3、 2yL的浓度为ΙΟμΜ的反向引物SEQ ID NO.4,和29.5yL重泡胀缓冲液加入到含有冻干扩增酶 的EP管中，混匀后再向其中加入2.5以1^浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少lOmin后获 得扩增产物，再按照每20yL扩增产物应用lyL的比例，加入浓度为200X的SYBR Green I。8. 根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于:操作步骤还包括，取扩增产物30yL 加入100yL无水乙醇后，12000rpm/min离心5min，去除液体后再加入30yL双蒸水，最后进行 琼脂糖凝胶电泳检测。9. 权利要求1所述的引物组在制备筛选人类EGFR基因多态性的检测试剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体组合运用了等位基因特异性扩增、重组酶聚合酶扩增、肽核酸结合DNA和SYBR？GreenⅠ显色四种分子生物学方法。以肺癌EGFR基因多态性为筛选对象，进行基因多态性筛选方法的研究。获得了一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组、试剂盒及其检测方法；引物序列如SEQ？ID？NO.1～5。可用于对EGFR多态性的筛选和对适合于靶向治疗的患者的鉴别。本发明所述方法不需要任何大型设备，或侧流筛选试纸的精密试剂、在特异性、敏感性、简便性和即时筛选等方面都具有很大优势，预计这种方法将是未来筛选基因多态性、与基因筛查发展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速筛选方法。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105648057
【申请号】
【发明人】王琪, 吕建新, 杜小慧, 刘元斌, 李恩成, 郭哲, 赵辉, 于若飞, 邝言斌
【申请人】大连医科大学附属第二医院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月26日