一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种Bim基因缺失巧光定量PCR检测引物及 探针、检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 目前，肺癌在欧美等发达国家及我国恶性肿瘤中病死率最高，且其发病率逐年上 升，其中NS化C占80%~85%。近年来，肺癌的祀向治疗已取得重大进展，多类高效低毒的祀 向药物相继问世，并应用于临床，主要有WEGFR为祀点的祀向治疗、W血管生成为祀点的祀 向治疗、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP )、W法基尼转移酶为祀点的祀向治疗、肺癌反义寡核 巧酸祀向治疗和肺癌祀向疫苗等；吉非替尼为祀向治疗的代表性药物，为信号传导通路酪 氨酸激酶抑制剂。此外，W腺病毒为载体的基因治疗在临床中有着广泛的应用前景。目前多 数研究证实，吉非替尼等EGFR-TKI可通过增加细胞内Bim数量诱导细胞内源性调亡。Bim重 组腺病毒转染对EGFR突变NSCLC细胞调亡具有诱导作用，可能机制为上调细胞内Bim蛋白表 达;此为NS化C的基因治疗提供了依据，但关于Bim肿瘤抑制因子在肿瘤基因治疗方面的研 究甚少。
[0003] Bim作为重要的调亡调节蛋白，不仅在消除自身免疫，维持造血细胞内环境的稳定 中起着重要的调节作用，而且对病理损伤(如神经退行性变、肿瘤、癒痛等)细胞具有强大的 杀伤功能。有关细胞调亡的研究使人们意识到，诱导细胞调亡可作为治疗肿瘤的新途径。 Bim为近年来研究比较热口的一种调亡调节蛋白，已有研究报道人类Bim基因定位的染色体 区域位于很多肿瘤的染色体区域内，且主要是造血系统来源的肿瘤。Bim基因的缺失可导致 多种肿瘤的发生，其中多为造血系统肿瘤，从而强有力地证明Bim是一种肿瘤抑制因子。王 等用免疫组织化学方法研究发现在正常增殖期子宫内膜、非典型增生子宫内膜、子宫内膜 癌运一过程中Bim蛋白的表达量逐渐降低。Bim的促调亡功能，使其成为肿瘤基因治疗中的 一个理想祀目标。
[0004] Bim(Bcl-2interacting mediator of cell death)是Bc]_-2家族中肌3-〇nly亚家 族成员，是一种重要的调亡调节蛋白，是O'Connor et all于1998年发现的，人类Bim基因位 于2ql2或2ql3,由6个外显子和3个内含子组成。Bim异构体的形成是由Bim前体mRNA的选择 性剪接而产生。由于各异构体mRNA保留了不同的外显子序列，从而使得Bim各异构体具有不 同的结构域，促调亡活性也有所不同。目前已发现Bim存在11种异构体。Bim蛋白属于Bcl-2 家族，仅含Bcl-2家族4个同源结构域(BH1-4)中的B册结构域，而B册域被认为是细胞调亡起 始的必需因子，可通过括抗抗调亡因子的作用或直接与Bax等相互作用并共同转位到线粒 体膜上引起细胞色素 C释放而诱导细胞调亡。Bim在多种正常细胞中均有表达，其中包括造 血细胞、上皮细胞、神经细胞及生殖细胞等。最近的研究发现，Bim基因作为抑癌基因，其表 达缺失可促使多种肿瘤的发生，包括前列腺癌，乳腺癌，子宫内膜癌等。而且Bim也是许多抗 肿瘤药物诱导细胞调亡的重要介质之一。Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生，其中多为 造血系统肿瘤。Bim在酪氨酸激酶抑制剂诱导表皮生长因子受体突变的非小细胞肺癌细胞 株调亡过程中起重要作用，也与白血病细胞对糖皮质激素的耐药性相关，用Bim基因表达载 体转染肿瘤细胞有可能成为肿瘤基因治疗的新途径。
[000引目前常用于检测Bim基因缺失的方法主要有：直接测序法、巧光原位杂交 (florescence in situ hybridization，FISH)、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC)、逆牵专录聚合酉每链反应（reverse transcription-poIymerise chain reaction,RT-PCR)。直接测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但是它却存在检测周期长、操作过程复 杂，易被污染，测序结果的判读较复杂、费时，费用较高等缺点，此外，对于检测异质性较高 的临床肿瘤组织样本是，直接测序法假阴性率高。巧光原位杂交可W对染色体或特定基因 的数目异常，特定片段的缺失、易位和重排进行诊断研究，但工作量大而复杂，效率较低。免 疫组织化学的检测成本较低，大部分医院的病理科都可W开展，但IHC检测取决于Bim基因 的表达量和相应抗体的特异性与敏感性，在未发现理想的抗体之前，IHC检测的准确性和重 复性尚难保证。RT-PCR的基本原理是首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将RNA逆 转录为单链的CDNA，再通过PC时尋CDNA扩增，电泳后确证结果，具有敏感特异、所需组织量极 少等优点，但对组织中RNA的质量有较高要求，若组织中的RNA降解严重，则可能影响最终的 检测结果，且费时，检出率较低，难W在常规工作或基层实验室推广普及应用。然而现有检 测方法存在无法同时兼顾适用于临床样本、检测方法简便易行、准确率高、灵敏度高、结果 判定简洁快速准确的缺点。
[0006] 实时巧光定量PCR技术（real-time fluorescent quanti1:ative PCR，FQ-PCR)于 1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同 时加入一个特异性的巧光探针，该探针为一寡核巧酸，两端分别标记一个报告巧光基团和 一个泽灭巧光基团。探针完整时，报告基团发射的巧光信号被泽灭基团吸收；刚开始时，探 针结合在DNA任一一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5 '端-3 '端外切酶活性将探针酶切降解， 使报告巧光基团和泽灭巧光基团分离，从而巧光监测系统可接收到巧光信号，即每扩增一 条DNA链，就有一个巧光分子形成，实现了巧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术 不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、 自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和 医学研究等领域，然而应用于BIM缺失突变的检测引物及探针或试剂盒未见报道。
[0007] 综上所述，为了临床上实现治疗肺癌的目标，本领域内需要开发简便易行的、准确 率高、灵敏度高的检测方法和/试剂盒，尤其是适用于临床样本检测的方法和/试剂盒，W用 于检测BIM缺失突变，便于指导机体的个性化治疗。
【发明内容】
[0008] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于巧光定量PCR检测Bim基 因缺失突变的检测引物及探针、检测试剂盒。
[0009] 本发明的目的之一是提供一种Bim基因缺失巧光定量PCR检测引物及探针，正向引 物序列为Forward Primer:5'-CAACAAACCCATCAGAACAGACAC-3'、反向引物序列为 ReversePrimer: 5 ' -ACAGCCTCTATGGAGAACAGTGATT-3 '，巧光探针序列为I^qman-Probe: 5 ' -FAM-CAGACACTGGAACAAA-MGB-3 '，巧光探针的5^端标记FAM巧光报告基团，3 '端标记MGB巧光 泽灭基团。
[0010] 本发明基于巧光定量PCR方法，实时巧光定量PCR把核酸扩增、杂交、光谱分析和实 时检测技术结合在一起，借助于巧光信号检测PCR产物，解决了传统PCR技术不能定量和扩 增产物污染的问题，避免了普通定量PCR操作过程中的污染，使其操作简便、快捷，结果准 确，已成为基因表达定量的强有力的工具，具有敏感性和特异性高、重复性好及定量范围广 等特点。定量检测要求检测方法敏感、特异、准确、精确、重复性好、线性范围广，且在各个基 因型之间无差异。全自动的巧光定量PCR因其更优异的准确性、精确度和可重复性，成为最 有前景的定量检测技术。
[0011] Bim基因缺失巧光定量PCR检测的原理为:采用巧光定量PCR方法对Bim基因缺失进 行定量检测。分别针对Bim基因的保守