鼠疫耶尔森氏菌荧光定量引物、检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，尤其涉及鼠疫耶尔森氏菌荧光定量引物、检测方法及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的一种广泛流行于人类和啮齿动物的自然疫源性 疾病，主要以蜱、蚤等传播媒介为主。目前自然界中已有数百种动物被证实可以感染鼠疫。 由于生态环境的因素及传播方式的多样化，鼠疫在自然界动物中广泛流行，如鼠类、兔类、 旱獭等。鼠疫耶尔森氏菌传播往往先在鼠类中流行，导致大批鼠类死亡，当病鼠死亡后，蜱 将寄生宿主转向人类，并通过吸血的方式把鼠疫传给人类，从而造成人间鼠疫。20世纪90 年代以来，鼠疫在全球范围内明显回升，人间病例迅速增多。
[0003] 鼠疫的传统检测方法为"四步检测法"，此方法虽然能够检测鼠疫的流行状态，但 是耗时长，操作繁琐，不能够给予及时准确的指导意见。因此，快速准确的检测鼠疫耶尔森 氏菌具有重要意义。
[0004] 随着分子生物学的飞速发展，荧光PCR的应用大大缩减的检测的时间和精力。实 时荧光定量PCR检测技术实时荧光定量PCR是近年来应用比较广泛的检测技术。具有快速 便捷、特异性高、敏感性好、定量准确等优点。主要包括SYBRGreenI随机掺入法和TaqMan 探针法两种检测方法。该技术把PCR、分子杂交和光化学等优点合为了一体，拥有基因扩增 的敏感性，分子杂交的特异性和光化学的精确性。实时荧光定量PCR是近年来发展较快、应 用较多的检测技术，具有操作便捷、高特异性、高敏感性等优点。
[0005] 因此，建立鼠疫耶尔森氏菌的检测方法能够实现对鼠疫耶尔森氏菌的快速、准确 检测。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供鼠疫耶尔森氏菌荧光定量引物、检 测方法及试剂盒，本发明提供的引物具有良好的重复性、灵敏性和特异性。本发明提供的方 法能够实现对鼠疫耶尔森氏菌的快速、准确检测。
[0007] 本发明提供了鼠疫耶尔森氏菌荧光定量检测引物组，包括如SEQIDN0:1所示核 苷酸序列的上游引物和如SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物。
[0008] 本发明还提供了如SEQIDN0:3所示核苷酸序列的鼠疫耶尔森氏菌荧光定量检测 探针。
[0009] 在本发明的实施例中，探针的3'端连接有FAM荧光标记基团。
[0010] 本发明根据鼠疫耶尔森氏菌的保守序列设计合成对应鼠疫耶尔森菌荧光定量引 物，根据此菌与GenBank所公布的序列进行比对，所设计的引物和探针完全匹配。因此，本 发明提供的探针和引物用于鼠疫耶尔森氏菌的荧光定量检测具有良好的特异性、重复性和 灵敏性。其能检测出的最低拷贝数为1. 66XIO2Copies/yL。
[0011] 本发明还提供了鼠疫耶尔森氏菌的检测方法包括：以如SEQIDNO: 1所示核苷酸 序列的上游引物、如SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物扩增扩增待测样品DNA，以如SEQIDN0:3所示核苷酸序列的探针检测，经荧光定量PCR获得荧光信号。
[0012] 根据荧光信号值及扩增曲线获得样品中是否含有鼠疫耶尔森氏菌，具体为：荧光 信号Ct值< 28. 0,并出现典型的扩增曲线，试验无效；
[0013] 无荧光信号Ct值或无扩增曲线，待测样品为阴性，不含鼠疫耶尔森氏菌；
[0014] 荧光信号Ct值<30.0,并出现典型的扩增曲线，待测样品为阳性，含有鼠疫耶尔 森氏囷。
[0015] 待测样品DNA对待测样品组织提取获得。
[0016] 在本发明的实施例中，DNA的提取方法为：
[0017] 步骤1 :将动物组织在液氮中粉碎后，粉末组织放于I. 5rnl离心管中；
[0018] 步骤2 :加入180yL缓冲液ATL，然后加入20yL蛋白酶K，于56°C温育1~3小 时，每隔20min取出轻轻旋祸，观察直到组织完全溶解；
[0019] 步骤3 :取出离心管短暂离心，然后加入200yL的缓冲液AL，短暂祸旋15s，37°C 温育IOmin;
[0020] 步骤4 :短暂离心后加入200yL无水乙醇，轻轻祸旋15s，短暂离心；
[0021] 步骤5 :将上述样品加入到QIAampMinispincolumn收集管中，8000rpm离心 Imin，弃滤液；
[0022] 步骤6 :加入500yL缓冲液AWl，8000rmp离心Imin，弃滤液；
[0023] 步骤7 :加入500yL缓冲液AW2,全速离心2min，弃滤液；
[0024] 步骤8 :更换柱子的收集管，全速离心Imin;
[0025] 步骤9 :将柱子放置到新的I. 5ml离心管上，加入100y1缓冲液AE，室温下放置 lmin，8000rmp，离心Imin0
[0026] 提取待测样品所用缓冲液ATL、缓冲液AU缓冲液AW1、缓冲液AW2、缓冲液AE、 QIAampMinispincolumn收集管来自DNA提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。
[0027] 在本发明的实施例中，荧光定量PCR的反应体系为：
[0028]
[0029] 本发明提供的荧光定量PCR反应体系进行扩增能够获得良好的扩增曲线，提高实 验的准确性。
[0030] 在本发明的实施例中，real-timePCR检测的程序为：
[0031]
[0032] 本发明提供的荧光定量PCR引物退火温度为65°C或62°C，以此温度检测，能够提 尚实验的特异性。
[0033] 在本发明的实施例中，SEQIDNO: 1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为IOpmol/ L;SEQIDN0:2所示核苷酸序列的上游引物的浓度为10pmol/L;SEQIDN0:3所示核苷酸 序列的探针的浓度为l〇pmol/L。
[0034] 本发明还提供了鼠疫耶尔森氏菌的检测试剂盒，包括：SEQIDN0:1所示核苷酸序 列的上游引物、SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物，和SEQIDN0:3所示核苷酸序列 的探针。
[0035] 在本发明的实施例中，试剂盒还包括dNTP、Taq酶、PCR反应缓冲液。
[0036] 在本发明的实施例中，还包括ddH20、96孔板和光学反应盖膜。
[0037] 本发明以鼠疫耶尔森氏菌的保守序列作为检测靶目标，提供用于鼠疫耶尔森氏菌 的荧光定量检测的探针和引物，以该引物和探针对鼠疫耶尔森氏菌进行检测，能够具有良 好的特异性、重复性和灵敏性。本发明通过实验证实，以本发明提供的引物和探针对鼠疫耶 尔森氏菌进行检测，准确性可达100 %，对其他病毒未见非特异性的扩增，特异性良好。通过 对不同拷贝的鼠疫耶尔森氏菌标准品系时候进行检测，该引物和探针对鼠疫耶尔森氏菌能 检测出的最低拷贝数为1.66X102coPies/yL，具有良好的灵敏性。在标准品的扩增曲线、 标准曲线中，不同梯度标准品间相关系数（R2)为1，扩增效率E= 101%，标准曲线的斜率 为-3. 278,截距为44. 332,回归方程为Ct= -3. 2781gN+44. 332。表明本发明提供的引物和 探针具有良好的扩增效果，实验结果准确可靠。
【附图说明】
[0038] 图1示按照实施例1的反应体系及条件分别对不同菌进行检测的结果。
【具体实施方式】
[0039] 本发明提供了鼠疫耶尔森氏菌荧光定量引物、检测方法及试剂盒，本领域技术人 员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用 已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对 本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0040] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0041] 鼠疫耶尔森氏菌标准品的制备方法为：
[0042] 首先，将鼠疫耶尔森氏菌EV株（由吉林鼠疫防控中心馈赠）涂在LB固体培养基 上，从固体平板培养基上挑取单个菌落，接种于IOOmL的液体LB培养基中进行170r/min， 37°C培养72小时。培养后，取1~4mL的菌液，12000rpm离心2min，弃去上清液；观察其中 沉淀量，如沉淀过小，需多富集几次，将沉淀混合收集在一起，提取DNA。
[0043] 将提取的鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA作为模板，通