专利名称：食品致敏原虾成分实时荧光pcr检测引物和探针、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及食品致敏性成分的基因检测方法。尤其是食品致敏原虾成分的实时荧 光PCR检测方法及其中所涉及的特异性引物、探针和相关试剂盒。
背景技术：
研究表明，发达国家对食物过敏反应的人群约占3. 5 5%，这些过敏性人群即使 摄入含微量过敏源的食物，也会产生很严重的过敏性反应，甚至致命。此外，乳糖和小麦蛋 白的耐受量也值得过敏性人群的关注。过敏性人群必须避免含有相关过敏源或超过耐受限 量的食物，因此，必须对任何含有潜在致敏反应的食物进行合理的标识。欧盟关于食品配料 标签要求的2003/89/EC指令规定，任何含有该指令所涉及的过敏源的产品必须标识。该指 令列出了所有过敏源食物，包括任何含有或源自谷物(肤朊/小麦蛋白)、甲壳类动物、鸡 蛋、鱼类、花生、大豆、乳及乳制品(包括乳糖)、坚果(榛子、杏仁、巴西坚果、腰果、开心果、 胡桃、美洲山核桃、澳大利亚坚果、昆士兰坚果)、芝麻、芹菜、虾及硫酸盐；此外，欧盟06年 新增了羽扇豆(Lupin)和软体动物(mollusa)作为新的过敏源(欧盟2006/142EC号指令)。 虾含有多种复杂致敏成分，蛋白是虾主要的致敏成分。其食用致敏症状主要表现为产生不 同程度的皮肤过敏现象，如浑身发痒和红斑等症状。过敏性疾病无法治愈，但避免食用含过 敏原的食物可以消除其症状，减轻并可能逆转其损害，并降低相关的健康风险。为了确保过 敏患者获得应有的警示和不被误导，以及为规范监督食品标签的使用提供真实和准确的信 息，准确严格的检验方法是必不可少的。因此有必要建立针对虾过敏原准确、严格、灵敏的 检验方法。 目前针对食品致敏原的检测方法，主要有体内检测的皮肤试验和双盲安慰剂对照
激发试验，体外检测的血清IgE试验和组胺释放试验、PCR检测等。传统的体内检测试验直
接检测是否存在过敏蛋白质，由于过敏蛋白质通常痕量存在而被食品基质掩盖，造成试验
结果假阴性。DNA比蛋白质更耐受热处理和压力作用，尤其是对于一些过敏原很难获得相应
的血清抗体。PCR方法中，在热变性条件下目标DNA可以有效提取而不像蛋白提取时受食物
基质的影响较大，它的另一个优点是稳定性，不像蛋白质组成那样受地理条件和季节变化
的影响。但是常规的PCR特异性较实时荧光PCR低，且存在污染问题。 实时荧光PCR技术于1996年由美国A卯lied Biosystems公司推出，它通过在PCR
扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程。由于该技术不仅实现了 PCR
从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异准确、可有效解决PCR污染问题、自
动化程度高等特点，目前已广泛应用于各种基因的检测。
发明内容
本发明的目的即在于提供方便、快速、灵敏地定量检测食品中致敏性虾成分的实 时荧光PCR方法，以及检测中所使用的包含特异性引物及探针序列的试剂盒。
3
为实现上述目的，本发明首先提供食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测引物和探 针，它们分别是 ①虫下16S rRNA基因I的检测引物和探针序列 正向引物(SEQ ID NO. 1): 5' -GATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGCG-3'， 反向引物(SEQ ID NO. 2) :5' -TAAAGGTCGAACAGACCTTCTCACT—3'，
探针(SEQ ID NO. 3): 5' -FAM-CTTCCTTGAAAGTTCATATCGACAGGAAGGG-Eclipse-3';
②虫下16S rRNA基因II的检测引物和探针序列
正向引物(SEQ ID NO. 4) :5' -AAGTCTAGCCTGCCCACTG—3'，
反向引物(SEQ ID NO. 5) :5' -GTCCAACCATTCATACAAGCC—3'，
探针(SEQ ID NO. 6): 5' -FAM-AGACTAATGATTATGCTACCTTCGCACGGTC-Eclipse-3';
③北极虾16S rRNA基因的检测引物和探针序列
正向引物(SEQ ID NO. 7) :5' -ATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGC-3'，
反向引物(SEQ ID NO. 8) :5' -ACCTTAATTCAACATCGAGGTC—3'，
探针(SEQ ID NO. 9): 5' -FAM-ACTCCCGTCGATAAGAACTCTCAGGG-Eclipse-3'。 在此基础上，本发明还提供致敏原虾成分实时荧光PCR检测试剂盒，所述的试剂 盒包括检测溶液，该检测溶液中含有10mM Tris Cl、50mM KCl、25mMMgCl2、 dNTP各2. 5mM、 Taq DNA聚合酶5U/ y L以及分别针对虫下16S rRNA基因1、虫下16S rRNA基因II和北极虫下 16S rRNA基因的检测引物和探针，分别是 虫下16S rRNA基因I的检测引物对(SEQ ID NO. 1， SEQ ID NO. 2)和探针(SEQID NO. 3)各10 ii M ; 虫下16S rRNA基因II的检测引物对(SEQ ID NO. 4， SEQ ID NO. 5)和探针(SEQ ID NO. 6)各10 ii M ; 北极虫下16S rRNA基因的检测引物对(SEQ ID NO. 7， SEQ ID NO. 8)和探针(SEQ ID NO. 9)各10 ii M。 本发明进一步提供了利用上述试剂盒检测食品致敏原虾成分的实时荧光PCR检 测方法，该方法使用上述试剂盒，包括如下步骤
①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液； ②反应体系取1 Pi步骤①制得的模板DNA溶液，加入10 1试剂盒中的检测溶 液和14 1灭菌超纯水，总体积25ul ;将以上各组分加入至0. 2mL实时荧光PCR反应管中， 混匀，5000r/min，离心10s ; ③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测95°C /10s，l个循环； 95°C /5s，60。C /34s，40个循环; 每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。
本发明方法采用T叫Man探针技术，能够对虾致敏原成分进行鉴定。实时荧光检测 系统能够实时监测反应进程，无需电泳，闭管操作，防止污染，并能够对结果进行快速判定。
4本发明适用于食品(调味汁等精加工食品除外)及其原料产品中致敏原虾成分的定性检 测。在测定原料产品时参考的测定低限量(L0D)为lmg/kg。是针对食品中虾致敏原成分的 稳定、特异、快速的切实可行的实时荧光PCR检验方法
具体实施例方式
下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说 明，但并不以任何形式限制本发明的内容。 若无特殊说明，本部分试验所用虾、虎头蟹、海蟹、赤甲蟹、虾爬、韭菜、油菜、大蒜、 银鱼、比目鱼、黄花鱼、细香葱、红辣椒、辣根、鲤鱼、鲫鱼、鱖鱼、鳕鱼、青鱼、小麦、大马哈鱼、 紫石房蛤、江瑶贝、章鱼等56种样品由大连水产研究所和大连水产学院等单位提供。DNA 提取试剂盒(货号D9093)购于宝生物工程(大连)有限公司。ABI 7500实时荧光PCR仪 (ABI公司，美国)，高速离心机centrifuge 5804(E卯endorf公司，德国)。
实施例1 —、食品致敏性虫下成分实时荧光PCR检测引物和探针的设计 根据同源性基因筛查比较结果，选择具有很高特异性的管家基因虫下16SrRNA基因 I(SEQ ID NO. 10)、虫下16S rRNA基因II(SEQ ID NO. 11)及北极虫下16S rRNA基因(SEQ ID NO. 12)为检测扩增的目标基因。据NCBI上已公布的上述基因的核酸序列，并通过对检测引 物和探针的退火温度的一致性以及GC含量的相似性等因素的综合考虑，设计了如下特异 性引物和探针 ①虫下16S rRNA基因I的第一对检测引物和探针序列 正向引物(SEQ ID NO. 1): 5' -GATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGCG-3'， 反向引物(SEQ ID NO. 2) :5' -TAAAGGTCGAACAGACCTTCTCACT—3'，
探针(SEQ ID NO. 3): 5' -FAM-CTTCCTTGAAAGTTCATATCGACAGGAAGGG-Eclipse-3';
②虫下16S rRNA基因II的第二对检测引物和探针序列
正向引物(SEQ ID NO. 4) :5' -AAGTCTAGCCTGCCCACTG—3'，
反向引物(SEQ ID NO. 5) :5' -GTCCAACCATTCATACAAGCC—3'，
探针(SEQ ID NO. 6): 5' -FAM-AGACTAATGATTATGCTACCTTCGCACGGTC-Eclipse-3';
③北极虾16S rRNA基因的检测引物和探针序列
正向引物(SEQ ID NO. 7) :5' -ATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGC-3'，
反向引物(SEQ ID NO. 8) :5' -ACCTTAATTCAACATCGAGGTC—3'，
探针(SEQ ID NO. 9): 5' -FAM-ACTCCCGTCGATAAGAACTCTCAGGG-Eclipse-3'。
二、食品致敏性虫下成分实时荧光PCR检测试剂盒的构建 在获得的上述特异性引物对及探针基础上，设计用于食品中致敏原虾成分实时荧 光PCR检测试剂盒，该试剂盒检测溶液中含有10mM Tris Cl、50mMKCl、25mM MgCl2、 dNTP 各2. 5mM、Taq DNA聚合酶5U/ ii L以及分别针对虫下16S rRNA基因I (SEQ ID NO. 10)、虫下16SrRNA基因II(SEQ ID NO. 11)和北极虫下16S rRNA基因(SEQ ID NO. 12)的检测引物和探针， 分别是 虫下16S rRNA基因I的检测引物对(SEQ ID NO. 1， SEQ ID NO. 2)和探针(SEQID NO. 3)各10 ii M ; 虫下16S rRNA基因II的检测引物对(SEQ ID NO. 4， SEQ ID NO. 5)和探针(SEQ ID NO. 6)各10 ii M ; 北极虫下16S rRNA基因的检测引物对(SEQ ID NO. 7， SEQ ID NO. 8)和探针(SEQ ID NO. 9)各10 ii M。 三、食品致敏性虫下成分实时荧光PCR检测方法的建立
1、DNA样品制备
本实施例采用…… 本实施例的DNA样品制备方法参考《DNA及RNA基本实验技术》(科学出版社， A. J.哈伍德主编，盛小禹等译)，具体为 (1)制样称取约200g样品，用研钵或粉碎装置将样品粉碎至粉末状。
(2)样品的总DNA提取 ①称取50mg待测样品于1. 5mL离心管中，加入600 y L裂解液，65°C 30min，每隔 10min振荡混匀; ②2000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400 y L由三氯甲烷和异 戊醇按照体积比24 : l组成的混合溶液，充分混匀； ③2000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加0. 8倍体积异丙醇，室温 下沉淀lh 2h ; 2000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50y LTE，溶
解沉淀。 也可用等效的商业化核酸提取试剂盒提取模板DNA。
(3) DNA浓度和纯度的测定取5yL由步骤(2)制得的DNA溶液加ddH20梯度稀释至lmL，使用核酸蛋白分析
仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照如下公式计算获得 C = AXNX50/1000，式中 C为DNA浓度(y g/ y L); A为260nm处的吸光值； N为核酸稀释倍数； 10D260nm = 50 ii g/mL双链DNA ; 当OD26。/OD28。比值在1. 7 1. 9之间时，适宜于PCR扩增。
2、实时荧光PCR检测 使用本实施例所建立的试剂盒，采用实时荧光PCR检测方法检测食品中致敏原虾 成分，包括如下步骤 ①反应体系取1 Pl步骤①制得的模板DNA溶液，加入10 i！ 1试剂盒中的检测溶 液和14 ii 1灭菌超纯水，总体积25ul ;②将以上各组分加入至0. 2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s ; ③将离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放 顺序； ④实时荧光PCR反应程序为95。C/10s，l个循环；95。C/5s， 60°C/34s， 40个循环， 在每次循环的退火时收集荧光； ⑤检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，其中Ct值(cycle threshold)是 指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数； ⑥每个样品设置两个平行的反应体系；检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对
照和空白对照用已知含虾成分的样品作阳性对照，用已知不含虾成分的样品作阴性对照，
用等体积的ddH20代替模板DNA作空白对照。 3、结果判断 (1)对照结果 空白对照无荧光增幅现象； 阴性对照无荧光增幅现象； 阳性对照有荧光增幅现象； 否则，实验视为无效； (2)检测结果的判定 ①同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测样品无荧光增幅现象，判 断样品中未检出致敏原虾成分； ②同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测样品有明显的荧光增幅曲 线，且Ct值《35 ，判断样品中检出致敏原虾成分； ③同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，若检测样品荧光增幅曲线的Ct
值在35 40之间，则应重新进行实时荧光PCR反应，再次扩增后的结果Ct值仍在35 40
之间，可判断样品中检出致敏原虾成分，否则可判断样品中未检出致敏原虾成分； ④在三组引物与探针中，若其中的一组引物与探针检测结果为阳性，以及检测中
的两个平行样中有一个样品检测结果为阳性，即可判断该样品中检出致敏原虾成分。 检测过程中按照GB/T 27403操作防止交叉污染 实施例2、特异性试验 采用实施例1的含有特异性引物和探针的检测试剂盒及检测方法检测虾致敏原 样品。同时检测虎头蟹、海蟹、赤甲蟹、虾爬、韭菜、油菜、大蒜、银鱼、比目鱼、黄花鱼、细香 葱、红辣椒、辣根、鲤鱼、鲫鱼、鱖鱼、鳕鱼、青鱼、小麦、大马哈鱼、紫石房蛤、江瑶贝、章鱼等 非虾致敏原样品。以对方法的特异性进行评估。 检测结果阴性对照检测结的FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应 体系无污染；阳性对照检测结果的FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常；采用本发明检 测虾致敏原样品，结果都出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性；其他非虾致敏原样品检 测结果的FAM通道均无荧光信号检出，检测结果均为阴性；由上述实验结果可见，该发明方 法具有很好的特异性。 实施例3、原料产品中虾过敏原检测灵敏度试验 应用实施例1的特异性引物和探针，及相关的试剂盒和检测方法，采用过敏原阳性物质添加的方法，进行植物原料产品中虾过敏原测定低限的研究。 以不同质量的虾样品，研磨样品处理后，分别添加到不含虾致敏原的鱼粉基质中， 制备成20mg/kg、 10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、 lmg/kg共5个梯度添加样品，从高到低逐份添加 原料。应用实施例1的方法分别进行检测，以确定本发明方法的检测灵敏度。制备好的样 品分别进行检测，结果显示阴性对照检测结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应 结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果 正常；样品检测结果显示，浓度分别为20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、lmg/kg的虾过敏 原添加产物均能很好检出。结果表明该发明方法对植物原料产品中虾致敏原成分的检测灵 敏度较高，可以达到lmg/kg。
实施例4、应用于实际样品检测 采用实施例1的含有特异性引物和探针的检测试剂盒及检测方法，对实际样品进 行检测。实际检测样品包括虾、虾制品、婴儿食品及小食品和调料等共285份。检测结果如
下表所示
表1
样品名称样品 总数检测结J
不含虾致 敏原成分 的样品数含有虾致 敏原成分 的样品数含有虾致敏原 成分，与标识 不符的样品数
虫下3737
虫下制品9191
婴儿食品及小食品157121362 结果显示，所检测实际样品共285份，其中 检测虫下及虫下制品样品128份，测得含虫下致敏原成分阳性率为100% ;
检测婴儿食品及小食品样品157份，其中检测出含有虾致敏原成分样品36份，其 中2份样品含有虾致敏原成分，但样品标识显示为"不含虾致敏原"，检测结果与样品标识 不符；有7份样品不含有虾致敏原成分，但样品标识显示为"含有虾致敏原"，检测结果与样 品标识不符；其余样品检测结果与样品标识相符。 对上述检测结果，采用酶联免疫定量快速检测方法进行验证，结果相符。 由大量的实际应用结果可见，应用本发明方法检测虾致敏原成分，具有较好的应
用结果。 SEQUENCE LISTING 〈110〉曹际娟，郑秋月，徐君怡 〈120〉食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法
〈130>N/A
〈160>12 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>27
8:0121]
:0122] :0123]
〈212>DNA 〈213〉人工序列
〈400>1
:0124]
gatt朋gtta cttteggg3t朋cagcg
:0125] <210>2
:0126] 〈211〉25
:0127] 〈212>DNA
:0128] 〈213>人工序列
:0129] 〈400>2
:0130] taaaggtcga acagaccttc tcact 25
:0131] 〈210〉3
:0132] 〈211>31
:0133] 〈212>DNA
:0134] 〈213>人工序列
:0135] 〈400>3
:0136] cttccttgaa agttcatatc gacaggaagg g 31
:0137] 〈210>4
:0138] 〈211>19
:0139] 〈212>DNA
:0140] 〈213>人工序列
:0141] 〈400>4
:0142] aagtctagcc tgcccactg 19
:0143] 〈210>5
:0144] 〈211>21
:0145] 〈212>DNA
:0146] <213>人工序列
:0147] 〈400〉5
:0148] gtccaaccat tcatacaagc c 21
:0149] 〈210>6
:0150] 〈211>31 <212>廳 〈213〉人工序列 〈400>6 agactaatga ttatgctacc ttcgcacggt c 31 〈210>7 〈211>25 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>7
〈210>8〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8accttaattc aacatcgagg tc22<210〉9〈211>26〈212>DNA<213>人工序列〈400>9actcccgtcg ataagaactc tcaggg26〈210>10〈211>135〈212>DNA〈213>Pandalus spp.〈400>10gatteagtte ctttegggat aacagcgtea tcttccttga aagttcatetCg3C3gg朋g60ggttgcgacc tcgatgttga attaagattt ctctetggcg cagcagttet3gtg卿3gg120tctgttcgac cttte135〈210>11〈211>109<212〉DNA〈213>Pandalus spp.〈400>11aagtct滩cc tgcccactga atteittttte朋gggccgcg gtatactgaccgtgcgaagg60tegcateatc attegtcttt t朋ttg朋gg cttgtetg朋tggttggac109〈210>12〈211>85〈212>DNA〈213〉Pandalus borealis〈400>12EitteEigttac tttegggate acEigcgteEit tttccctgag agttcttetc gacgggagtg60cttgcgacct cgatgttgaa tteag85
10
权利要求
食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于是①虾16S rRNA基因I的检测引物和探针序列正向引物(SEQ ID NO.1)5′-GATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGCG-3′，反向引物(SEQ ID NO.2)5′-TAAAGGTCGAACAGACCTTCTCACT-3′，探针(SEQ ID NO.3)5′-FAM-CTTCCTTGAAAGTTCATATCGACAGGAAGGG-Eclipse-3′；②虾16S rRNA基因II的检测引物和探针序列正向引物(SEQ ID NO.4)5′-AAGTCTAGCCTGCCCACTG-3′，反向引物(SEQ ID NO.5)5′-GTCCAACCATTCATACAAGCC-3′，探针(SEQ ID NO.6)5′-FAM-AGACTAATGATTATGCTACCTTCGCACGGTC-Eclipse-3′；③北极虾16S rRNA基因的检测引物和探针序列正向引物(SEQ ID NO.7)5′-ATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGC-3′，反向引物(SEQ ID NO.8)5′-ACCTTAATTCAACATCGAGGTC-3′，探针(SEQ ID NO.9)5′-FAM-ACTCCCGTCGATAAGAACTCTCAGGG-Eclipse-3′。
2. 食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测试剂盒，包括检测溶液，其特征在于该检测溶 液中含有10mM Tris'Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、 dNTP各2. 5mM、Taq DNA聚合酶5U/ii L以 及分别针对虾16S rRNA基因I、虾16S rRNA基因II和北极虾16S rRNA基因的检测引物和 探针，分别是虫下16S rRNA基因I的检测引物对(SEQ ID NO. l，SEQ ID NO. 2)和探针(SEQID NO. 3) 各lOiiM ;虫下16S rRNA基因II的检测引物对(SEQ ID NO. 4， SEQ ID NO. 5)和探针(SEQ ID NO. 6) 各lOiiM ;北极虾16S rRNA基因的检测引物对(SEQ ID NO. 7， SEQ ID NO. 8)和探针(SEQ ID NO. 9)各10 ii M。
3. 食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于使用权利要求2所述的试剂 盒，包括如下步骤① 提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；② 反应体系取1 Pi步骤①制得的模板DNA溶液，加入10 1试剂盒中的检测溶液和 14iU灭菌超纯水，总体积25ul ;将以上各组分加入至O. 2mL实时荧光PCR反应管中，混匀， 5000r/min，离心10s ;③ 步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测95 °C /10s，l个循环； 95°C /5s，60。C /34s，40个循环;每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。
全文摘要
本发明涉及食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法。该引物和探针分别是序列为SEQ ID NO.1～3的虾16S rRNA基因I的检测引物和探针、序列为SEQ ID NO.4～6的虾16S rRNA基因II的检测引物和探针、序列为SEQ ID NO.7～9的北极虾16S rRNA基因的检测引物和探针。基于此，本发明公开了包含上述引物和探针序列的食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测试剂盒及相应的检测方法。本发明的探针和引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。
文档编号G01N21/64GK101748216SQ20101010049
公开日2010年6月23日 申请日期2010年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者徐君怡, 曹际娟, 郑秋月 申请人:曹际娟;郑秋月;徐君怡