专利名称：：一种基于荧光通用引物的多重定量rt-pcr基因表达谱分析方法
技术领域：
：本发明涉及涉及生物技术基因表达分析领域，具体涉及一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法。
背景技术：
：随着现代分子生物学技术和相关检测仪器的发展，基因表达谱分析也迅速发展起来。基因表达谱分析在分析基因功能，确定转录调控途径，阐明信号传导或代谢通路，研究表达水平多态性等方面中都发挥着至关重要的作用，并为分子药物、疾病诊断和治疗领域提供了帮助。人类复杂性状疾病的研究和相关基因的定位是当前的研究热点。糖尿病、癌症、早老性痴呆和精神分裂症等疾病的遗传机理和相关效应基因仍不为人知。通过全基因组转录图谱来查找候选基因(candidategenes)是复杂性疾病研究的第一步，也对进一步理解人类复杂性疾病和分子药物的研发提供了帮助。转录图谱也被用于癌症诊断和疗效比较等临床分析中。基因表达谱可以用于肿瘤分类，进一步研究发现大约30个基因的表达情况可用来预测肿瘤对化学治疗药剂的生物反应状况。全基因组表达芯片(Genome-widemicroarrays)能成功的从各种反应条件下筛选出差异表达的基因，这些基因也被作为候选基因进行假设验证和功能分析。芯片技术的优势是通量大，一次实验所能检测的基因量很大，样本量也较多，但同时也存在着明显的劣势就是芯片的定量准确度较低，并且实验成本很高，只能在经济实力雄厚的实验室推广。基因表达分析中最常用的技术就是实时逆转录定量PCR(real-timeqPCR)，它具有Northernblots等技术所不具有的定量分析能力，因此被广泛的用于基因表达定量分析中。Real-timeqPCR技术被证明具有稳定性好、灵敏度高和7个数量级的定量线性等优势，但同时它也具有检测通量小、样本处理费时费力成本高等缺点。有研究表明人类细胞大约还含有3万个基因，每个细胞平均有大约1万个基因参加表达，而10到50个基因表达和一种特定的疾病相关，10到50个基因和一个特定的通路和药物反应相关。考虑到多基因性状(multigenictraits)受到基因-环境的相互作用影响，发现它们的生物学基础需要在不同的环境条件下处理大量的样本，需要针对对适量的基因在适量的个体或样本中进行分析，因此一种中通量的基因表达分析方法亟待开发。这种基因表达谱检测平台能解决基因表达中高通量与低成本的瓶颈，一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种定量通量高(10-30个基因/反应)、成本低、样本需要量低、检测灵敏性高的多基因表达分析方法。本发明针对11个目的基因和3个看家基因设计了荧光通用引物和嵌合特异引物。通用引物的长度为20bp，上游通用引物5'端用Fam荧光标记，通用引物对小鼠基因组特异。嵌合特异引物长度为38bp，3，端为特异引物序列段(18bp)，5，端为通用引物序列段(20bp)。设计的特异引物段要求理论退火温度均为55t:，并且有相似的GC含量。扩增产物的长度在100400bp间，相邻产物长度差为57bp。本发明的方法有两种优化方案1.单序列荧光通用引物方案；设计单序列荧光通用引物，使通用引物的上下游序列采用同一序列。这样可以减少通用引物的引物二聚体对扩增反应影响，提高通用引物的扩增效率。2丄游嵌合特异引物降落式(Touchdown)PCR结合荧光通用引物补加方案。在PCR反应过程前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式(Touchdown)PCR过程，使各个目的基因的上游嵌合特异引物能最佳退火，同时通用引物的补加也能克服扩增反应初期的通用引物二聚体影响，提高了反应效率。本发明提供的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于包括下列步骤(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计通用引物的长度为20bp，上游通用引物5'端用Fam荧光标记，通用引物对小鼠基因组无非特异性匹配。针对11个目的基因和3个看家基因设计嵌合特异引物长度为38bp，3'端为特异引物序列段(18bp)，5，端为通用引物序列段(20bp)(2)多重RT-PCR反应过程a逆转录反应阶段，利用下游嵌合特异引物(chimericreverseprimer，3，端为一段基因特异序列，5'端为一段通用引物序列)逆转录合成目的基因的cDNA第一链；bPCR反应过程，前3个循环，上游嵌合特异引物将通用引物序列加到目的基因DNA片段的两端；PCR反应的余下循环，高浓度的荧光通用引物取代上游嵌合特异引物完成整个PCR反应过程；c根据荧光标记的PCR产物长度的不同，用ABI377测序仪凝胶电泳予以分析检测。步骤1中所述的通用引物设计上采用上下游同一序列作为通用引物序列。步骤2中所述的PCR反应过程，前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式(Touchdown)PCR过程，为11个循环。本发明结合了终点PCR法(end-pointPCR)和荧光检测法(fluorescentdetection),将多对嵌合特异引物的PCR反应转变为一对通用引物的PCR反应大大降低了PCR反应的复杂性，并且所有待扩目的基因片段也在一对通用引物的作用下被等效率扩增、比例的放大，从而实现多重定量检测。本发明适用于10-30个基因/反应的研究特定药物代谢途径或信号传导通路等特定候选基因表达分析，是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。图l为本发明的原理示意图，图中以一个目的基因模板表示(A)为利用下游嵌合特异引物的逆转转录反应；(B)为逆转录反应生成的目的基因cDNA单链；(C)为PCR反应的前三个循环，由上游嵌合特异引物引导，将通用引物序列加到cDNA模板两端；(D)为PCR反应余下循环，由通用荧光引物取代嵌合引物完成扩增；(E)为荧光标记的PCR产物通过ABIPrism377型核酸分析仪予以分析检测。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计试验步骤(l)通用引物的设计根据GenBank数据库的水稻序列信息，设计了两条20bp长的序列作为通用引物。设计原则是保证该引物在小鼠基因组上进行PCR反应无产物条带，避免通用引物带来非特异产物。通用引物的理论退火温度控制在55°C。上游通用引物5'端用Fam荧光标记。通用引物序列为Fam-cgggctacgctatctacgac(上游)与cgggcagtaagtaccgttgt(下游)。(2)上下游嵌合特异引物的设计根据GenBank数据库的11个小鼠目的基因和3个看家基因的cDNA序列信息，设计了14对18bp长的序列作为嵌合特异引物3，端的特异引物序列段。设计的特异引物段要求理论退火温度均为55。C，并且有相似的GC含量，设计完后在5'端加上通用弓I物序列。扩增产物的长度控制在100400bp间，相邻产物长度差为57bp。目的基因和看家基因的嵌合特异引物的序列为:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)所有引物尽量选择在mRNA特异的序列上设计，并经Blast和Oligomaster软件分析减少非特异扩增和引物二聚体对反应的影响。2.样本RNA的制备试验步骤(1)总RNA抽提采用TRIzol法。微量分光光度仪(U-008OD,HITACHI)控制抽提RNA的OD26固o在1.7~2.0间，浓度调整到1吗/pL。(2)用DNaseI(Invitrogen)消化TRIzol抽提的总RNA中混有的少量DNA污染。DNaseI消化反应体系为RNA1^L、10xReactionBuffer1|_iL、DNaseI(1U/pL)1pL，补水至10pL。反应过程为20°C15min，然后加1EDTA(25mM)，65°C10min使DnaseI失活。反应后的RNA浓度是100ng;L。3.多重RT-PCR反应及产物检测分析试验步骤(1)逆转录反应体系为5xReactionBuffer4pL、MgCl2(25mM)4.8pL、dNTPMix(2mM)ljxL、ImProm-IIReverseTranscriptase(Promega)lpL、下游嵌合引物(总浓度10pM)2pL、RNAtemplate(100ng/pL)2~3|iL，补水至20pL。反应过程为25。C5min，42。C60min，70。C15min。(2)PCR反应体系为PCRBuffer10xlpL、MgCl2(25mM)0.6pL、dNTPMix(2mM)1pL、5xQ-Solution2nL、DNAPolymerase(Qiagen)(5U/pL)0.1|jL、cDNAtemplate(1015ng/^iL)1pL、上游嵌合特异引物对(总浓度10pM)0.5pL、通用上下游引物对(10pM)0单，补水至10pL。反应过程为95°C15min;94°C30s，55°C90s，72°C60s，35cycles;72°ClOmin。(3)各取PCR反应产物1[iL、DNA分子标准1pL、3x上样缓冲液1混匀。上述混合物经95。C变性3min，迅速置于冰浴2min，立即上377测序仪(AppliedBiosystemsInc.)检测，电泳条件为电压3KV，电泳时间2.5h。电泳结果经GeneScan和GeneMapperID软件分析获得产物大小、峰高、峰面积等数据。产物大小由DNA分子标准得出，峰高用来预判目的基因的表达强度，峰面积(即PCR产物条带荧光强度)用于计算目的基因的相对表达量，公式如下目的基因相对表达量=目的基因峰面积—看家基因峰面积的几何平均数实施例22品系15天龄小鼠睾丸组织的性发育起始候选基因的表达分析——上游嵌合特异引9物降落式(Touchdown)PCR结合荧光通用引物补加优化方法试验步骤(1)解剖小鼠取睾丸组织，TRIzolReagent(Invitrogen)抽提组织的总RNA。用DNaseI消化TRIzol抽提的总RNA中混有的少量DNA污染。(2)下游特异引物逆转录合成目的基因的cDNA单链模板。逆转录反应体系为5xReactionBuffer4pL、MgCI2(25mM)4.8pL、dNTPMix(2mM)lfJL、ImProm-IIReverseTranscriptase(Promega)lpL、下游嵌合引物(总浓度lOpM)2pL、RNAtemplate(100ng/^iL)2~3^L，补水至20pL。反应过程为25。C5min，42。C60min，70。C15min。(3)上游嵌合特异引物降落式(Touchdown)PCR结合荧光通用引物补加扩增。PCR反应分为两个阶段进行，第一个阶段为前11个循环的TouchdownPCR循环，退火温度为60°C~50°C，每一个循环退火温度降低1°C。第二个阶段为通用引物对补加后的30个循环的PCR扩增，退火温度为55。C。反应体系为PCRBuffer1Ox1^1、MgCl2(25mM)0.6pl、dNTPMix(2mM)lpl、5xQ-Solution2^il、DNAPolymerase(5units4tl)0.1^1、cDNA模板(10~15ng4d)l|al、上游嵌合特异引物对(总浓度10pM)0.5^1、通用上下游引物对(10pM)0.5^1，补水至10^1。反应过程为95。C15min;94°C30s，退火90s，72°C60s，35cycles;72。C10min。(4)ABI377测序仪检测PCR反应产物。上样样本体系为PCR反应产物1^1(视浓度大小可稀释)、DNA分子标准(Rox荧光标记，分子片段大小为79bp、105bp、131bp、151bp、201bp、254bp、306bp)1^1、3x蓝色葡聚糖上样缓冲液1^1。配完上样体系经变性后(95°C3min后迅速置于冰浴放置5min)上377测序仪检测分析结果，电泳条件为电压3KV，电泳时间2.5h。电泳结果经GeneSc肌和GeneMapperID软件分析得到片段大小、各个目的产物的峰高值及峰面积值等有关数据。产物大小由DNA分子标准得出，峰高用来预判目的基因的表达强度，峰面积(即PCR产物条带荧光强度)用于计算目的基因的相对表达量，公式如下目的基因相对表达量=目的基因峰面积+看家基因峰面积的几何平均数(5)计算目的基因的相对表达量，筛选2品系小鼠睾丸组织间差异表达的基因。权利要求1.一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于包括下列步骤(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段，5’端为通用引物序列段；(2)多重RT-PCR反应过程a逆转录反应阶段，下游嵌合特异引物逆转录合成目的基因的cDNA第一链；bPCR反应过程，前3个循环，上游嵌合特异引物将通用引物序列加到目的基因DNA片段的两端；PCR反应的余下循环，高浓度的荧光通用引物取代上游嵌合特异引物完成整个PCR反应过程；(3)测序仪凝胶电泳予以分析检测。2.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于步骤(1)中设计扩增产物的长度在100400bp间，相邻产物长度差为57bp。3.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于步骤(1)中所述的通用引物为上下游同一序列。4.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR反应过程，前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式PCR过程，为11个循环。5.根据权利要求1或2或3或4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于所述的通用引物根据水稻序列设计，引物序列为FWD,5，-cgggctacgctatctacgac-3',REV,5，-cgggcagtaagtaccgttgt-3，。6.根据权利要求1或2或3所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于所述的嵌合特异引物根据11个小鼠目的基因和3个看家基因的cDNA序列信息设计，引物序列为ph伤FWD:c卿ctecgctefctecgacCGCAAAGGAAGACCGAGAREV:cgrgrgrcagteasffaccfif的n"GGACCTGCTGTCTTCTGG产物长度98bpPlaclFWD:c卿cfacgcfafcfacgacATCCGCATCAAGGCTGTCREV:cgrgfgrcagteagfaccg收fGATGAGCCCTTGGAAGCA产物长度114bpTmem32FWD:c卿ctecgcfafctecgacCCCACGAGCATGAACACAREV:cgggcagrteagfaccgr的fAGGCGGGGTTCCTATCAA产物长度122bpUsp26FWD:cgggctecgctete/acgacATGCCCAGACACAGCACAREV:cggrgcagteagteccg的fTGACACCGAACCATTCCA产物长度138bpDdx26bFWD:cgggctecgctetetecgacACGTGGCATTGAGGGAAAREV:cfifg^cagteagteccg^gfTCATGGAGGCGGACGTAT产物长度145bpPPIAFWD:c卿ctecgctetefacgacACGCCACTGTCGCTTTTCREV:cggrgrcasffaasrfaccsfffgfTGCAAACAGCTCGAAGGA产物长度152bpmospdlFWD:cggfgcfacgctetefacgacTTCCGAGGAGCCAGTGTTREV:cgggcagffaafifteccgffgffTGGCACTGGATCCCACTT产物长度164bpHsbst2FWD:c卿cfecgrfafctecgacTTCGGCCAGGTTTGTACCREV:cgggrcafifteagteccgrffgfAGGTGACGGCCAAAAGTG产物长度178bpGm773FWD:cgggcfacgcfafcfacgacAACCACATCACGGCAGGTREV:cgggrcagteagteccg^gfTCCAGGAAAGCCATTTGC产物长度187bpMbnl3FWD:cgggrcfacgcfafcfacgracTGGGCGTGGAGACAGTTTREV:cgggcagfteasfteccg的K3GCCTGACTTTTGCCAGA产物长度197bpGapdhFWD:cgggfCfacgcfafcfacgacCAATGTGTCCGTCGTGGAREV:cgggcagteagrfaccgtfg/GGCATCGAAGGTGGAAGA产物长度218bpFhllFWD:cgrgrgfcfacgctefcfacsracCAGGTGCAAAGGGTGCTTREV:cgfsrsfcagfaagteccsr收n"GGCCTTGTTGCACTTCA产物长度249bpCxxlb/CxxlaFWD:cgsfSfctecgctetetecsfacATGGCGAGATGGACAAGCREV:cggrgcagtaagteccg的fCGAACACCCGC丌CATCT产物长度256bpBeta-actinFWD:cgrgsfcfacgctefcfacsracCAACTGGGACGACATGgAREV:cgrgrgfcagrteagfaccgr的rcCATCACAATGCCTGTGG产物长度270bp7.根据权利要求1或2或3或4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于步骤(2)中所述的逆转录反应体系为5xReactionBuffer4nL、4.8浓度为25mM的MgCl2、lpL浓度为2mM的dNTPMix、l^L浓度为lJ/nL的ImProm-IIReverseTranscriptase,下游嵌合引物2pL总浓度10pM、23^L浓度为lOOng/pL的RNAtemplate,补水至20^L，反应过程为25。C5min，42。C60min，7(TC15min。8.根据权利要求1或2或3或4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR反应过程反应体系为PCRBuffer10xlpL、0.6pL浓度为25mM的MgCl2、1pL浓度为2mM的dNTPMix、5xQ-Solution2^L、0.1浓度为5U/pLDNAPolymerase、1nL浓度为1015ng4iL的cDNAtemplate、上游嵌合特异引物对0.5总浓度10pM、0.5pL通用上下游引物对10^M，补水至10^L，反应过程为95。C15min;94°C30s,55°C90s，72°C60s，35cycles;72°C10min。9.根据权利要求4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于:所述降落式PCR反应过程退火温度为6(TC5(TC，每一个循环退火温度降低1°C。全文摘要本发明涉及基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，包括下列步骤(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计，通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段，5’端为通用引物序列段；(2)多重RT-PCR反应过程；(3)测序仪凝胶电泳予以分析检测。本发明适用于10-30个基因/反应的研究特定药物代谢途径或信号传导通路等特定候选基因表达分析，是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。文档编号C12Q1/68GK101463389SQ200810207238公开日2009年6月24日申请日期2008年12月18日优先权日2008年12月18日发明者周宇荀,凯李,王勤熙,肖君华,赵丽亚申请人:东华大学