专利名称：用于抗炎药物筛选的细胞模型及利用其筛选药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种抗炎药物筛选方法。
背景技术：
炎症是活体组织对损伤或感染产生的一种以防御反应为主的病理过程。一方 面，炎症应答是机体针对损伤因子的防御反应，表现在局部血供增加，炎症细胞 进入炎症部位，血清蛋白渗出，从而控制感染，清除有害抗原异物。但是，炎症 又是一种病理过程，异常的免疫应答也可能导致组织坏死，造成功能障碍，甚至 危及病人的生命。由于炎症型疾病具有病程长、易反复、难治愈等特点，因此抗 炎药物的开发、评价和筛选对于炎症性疾病的治疗具有重要实际意义。
随着大规模化合物库的建立及组合化学、组合生物合成等新的研究领域的迅 猛发展，有待筛选的化合物数目显著增多，从而对抗炎药物筛选技术提出了更高 的要求，不仅需要更大的筛选规模和更快的筛选速度，同时也要求筛选模型能够 准确地反映被筛化合物的生物活性。根据实验对象的不同，抗炎药物的筛选可以 在分子水平、细胞水平和动物整体水平进行。分子水平筛选模型能针对特定靶点 的单指标进行检测，但无法对化合物的生物活性进行综合评价。动物水平的筛选
模型可以反映药物在体内的整体效果，但成本较高、药物作用机制不明确，不适 于高通量筛药。与分子水平和动物水平的筛选模型相比，细胞水平的筛选成本较 低，作用机制明确，更能适应高通量筛药的需求。目前，科研人员主要利用永生 化的人或啮齿类动物的细胞系进行抗炎药物的筛选。这种筛选方式能够实现药物 的快速筛选，但由于体外培养的永生化细胞已失去体内细胞的一些活性和特征， 筛选结果不能完全反映药物在体内的作用情况。
研究表明，原代培养的细胞与生物体内细胞性状相似性大，更能反映细胞在 体内真实的功能状态。因此将原代培养的细胞模型应用到抗炎药物的筛选将会弥
补当前筛药方法的不足。原代培养的细胞比永生化的细胞系更能代表体内的炎症 发生过程，因此，用于药物筛选的原代细胞模型能够为化合物抗炎活性的评价提 供更为可靠的工具。
炎症是一个复杂的过程，炎症发生过程涉及到多种细胞的活化和细胞因子的 释放。其中，巨噬细胞是参加炎症反应的一种重要的细胞。巨噬细胞是IL-la、 IL-lp、 TNF-a和IL-6等细胞因子的主要来源。其中，人白细胞介素1|3作为前炎性 细胞因子，是一种强有力的免疫调节物质，它能够刺激炎症细胞黏附分子的表达、 花生四烯酸释放、诱导NO合成。IL-lp使机体对感染和损伤产生系统或局部的反 应，在慢性和急性炎症反应、发热反应及脓毒性休克中起着重要的作用。此外， 人白细胞介素1P可以刺激机体产生氧自由基，导致细胞损害。大量研究表明IL-115 参与炎症性疾病的发生，在类风湿性关节炎、多发性结肠炎、脑缺血等疾病中是 重要的调节介质。研究表明，抑制血浆中人白细胞介素1|3活性可以减轻炎症反应 程度。因此开发以人白细胞介素1|3基因为靶标的抗炎药物将具有重大的社会意义 和经济价值。
IL-Luc转基因小鼠为一种可用于抗炎症药物筛选的工具小鼠(Li L, Fei Z, Ren J, et al. Functional imaging of interleukin 1 beta expression in inflammatory process using bioluminescence imaging in transgenic mice.BMC Immunol.2008，9:49)。该小鼠的基因组中含有一基因表达盒，该表达盒从5'到3'端依次具有以 下元件白介素1P启动子，报告基因，终止子。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种抗炎药物筛选的巨噬细胞模型。 本发明的另一目的是提供一种含有该巨噬细胞模型用于抗炎药物筛选的试
剂盒
本发明的另一目的是提供一种利用转基因小鼠原代巨噬细胞进行抗炎药物 筛选的方法。
具体来说本发明是通过以下技术方案来达到本发明的目的，主要包括以下几
个步骤'
第一步分离并培养IL-klC转基因小鼠的腹腔巨噬细胞；
第二步在原代培养的巨噬细胞中加入待筛选的化合物预处理巨噬细胞；
第三步利用炎症激发因子诱导巨噬细胞炎症的发生，建立巨噬细胞炎症模
型；
第四步检测化合物处理组与未处理组细胞报告基因的表达水平，评估化合 物的抗炎效果。
本发明建立了一种高效、可靠的抗炎药物筛选细胞模型。本发明首先分离 了人白细胞介素1P启动子驱动荧光素酶报告基因(IL-LUC)转基因小鼠的腹
腔巨噬细胞。在该巨噬细胞中含有一基因表达盒，该表达盒从5'到3'端依次具
有以下元件人白细胞介素1P启动子，荧光素素酶基因，终止子。本发明实 施例所使用的炎症相关因子的启动子是IL-ip，根据本发明的构思，其他的炎 症相关因子例如IL-la启动子、TNF-a启动子、IL-6启动子也可以应用于该方 法。
在原代培养的IL-Luc转基因小鼠的腹腔巨噬细胞中加入炎症激发因子激 发细胞中炎症的发生。常规的炎症激发因子包括脂多糖LPS、酵母聚糖、IL-lot、 TNF-ct、 IL-6、唑酮、病原微生物及其代谢产物。在脂多糖LPS诱导的巨噬细 胞模型中，单孔细胞量为1.0-9.9 x 104个，每孔RPMI-1640培养基为10(^1 ， 在培养基中加入LPS的终浓度范围为20ng/ml- 2pg/ml;在酵母聚糖诱导的巨 噬细胞模型中，单孔细胞量为1.0-9.9 x 104个，每孔11 ]^1- 1640培养基为10(Hd, 在培养基中加入酵母聚糖的终浓度范围为5(Vg/ml- 500ng/ml。 LPS和酵母聚糖 的最佳浓度分别为100ng/ml和125昭/ml。利用原代培养的IL-luc转基因小鼠 的腹腔巨噬细胞建立细胞炎症模型为本发明的创新点之一。在这种模型中，荧 光素酶基因的表达水平可反映出前炎症因子人白细胞介素lp的表达水平，从 而反映出细胞的炎症发生过程和程度。然后，我们将巨噬细胞炎症模型用于抗 炎药物的筛选。通过化合物抑制报告基因表达的程度来评价化合物的抗炎活 性。
本发明所建立的抗炎药物筛选系统兼具了常规细胞筛药模型和动物筛药 模型的优点。主要表现在
1、 本发明以原代培养的转基因小鼠腹腔巨噬细胞为工具细胞，该细胞能 够模拟体内炎症发生过程，与细胞株相比更接近生理状态，结果更可靠；
2、 本发明具有操作简单、快速、稳定的特点，适合大规模筛药；
3、 本发明所建立的筛选方法灵敏度高，104个巨噬细胞即可进行单孔实验；
4、 本发明所建立的筛选方法成本较低， 一只转基因小鼠可收获约106个腹 腔巨噬细胞，可同时用于多组药物的筛选实验。
5、 本发明选用人白细胞介素1P基因为靶点进行药物筛，作用机制明确。
图h LPS诱导荧光素酶表达的巨噬细胞数量梯度
图2: LPS诱导巨噬细胞荧光素酶表达时间曲线(11=3;与0小时比较* <0.01郑 <0.05)
图3:酵母聚糖诱导巨噬细胞荧光素酶表达的时间曲线(11=3;与0小时比较* < 0.01;#p<0.05)
图4: LPS诱导的巨噬细胞炎症模型中地塞米松对荧光素酶表达的抑制效果图
(11=3;与空白对照组比较fp〈0.01;与LPS诱导组比较#p<0.05) 图5:酵母聚糖诱导的巨噬细胞模型中地塞米松对荧光素酶表达的抑制效果图 (r^3;与空白对照比较* <0.01;与酵母聚糖诱导组比较#p<0.05)
具体实施例方式
一、 分离培养IL-luc转基因小鼠的腹腔巨噬细胞
1、 脱臼处死成年IL-luc转基因小鼠(该转基因小鼠由上海南方模式生物科 技发展有限公司实验室制备，制备方法参考文献Li L, Fei Z, Ren J, et al. Functional imaging of interleukin 1 beta expression in inflammatory process using bioluminescence imaging in transgenic mice. BMC Immunol.2008， 9:49)，放入75 %酒精中浸泡消毒。腹腔注射无血清的RPMI-1640培养液5 ml，仰卧平放并轻 揉小鼠腹部，静置5min。
2、 无菌条件下打开小鼠腹腔，吸取腹腔液，1000r/min离心10min，弃上清， 用PBS洗涤2遍后显微镜下进行细胞计数。
3、 用含10。/。胎牛血清和抗生素(青霉素100U/ml，链霉素100ng/ml)的 RPMI-1640培养液调整细胞至密度为l()S个/ml，接种于96孔板内(每孔100pl培 养基)，置于37匸，5%C02培养箱中培养。
4、 培养2h后吸去上清液，用PBS漂洗两遍，以去掉未贴壁细胞。然后在孔 板中加入含10%胎牛血清和抗生素的RPMI-1640培养液，置于在37。C， 5% C02培养箱中继续培养。
实验获得的巨噬细胞经台朌蓝染色可鉴定细胞存活率达95%。 一只小鼠可收 获约106个腹腔巨噬细胞。
二、 利用炎症激发因子激发巨噬细胞发生炎症反应 细胞培养液中加入各种炎症激活因子(脂多糖LPS或酵母聚糖)后，置于
37°C， 5%C02培养箱中培养若干小时。原代培养的巨噬细胞在炎症激发因子的 刺激下，细胞内的炎症因子得以大量表达，此时的巨噬细胞为发生炎症反应的巨 噬细胞。在n,-l"r.转基因小鼠的巨噬细胞中，人白细胞介素lp基因的启动子在 炎症激发因子的诱导下可驱动荧光素酶基因的大量表达。荧光素酶基因的表达状 况可反映细胞的炎症发生情况。
为了确定完成一次实验所需的细胞数量，本发明进行了细胞数量梯度实验 (图l)。结果表明，7200个细胞即可检测到明显的荧光素酶活性，明显低于常 规量。在后续的实验中，我们将细胞数量控制在1.0-9.9 xW个/ L。目前在大多 数筛药细胞模型中，每孔细胞的用量均在105以上。本发明中104个/孔细胞即可 得到理想的结果，应用本发明所述的巨噬细胞筛药模型体现了节约成本的优点。
LPS激发巨噬细胞炎症发生过程如图l所示，LPS诱导3h后，可以检测到 荧光素酶在细胞内大量表达，随后荧光素酶表达量下降。加入LPS24h后，细胞 内荧光素酶活性恢复到本底值。在酵母聚糖诱发的巨噬细胞炎症模型中，细胞内 荧光素酶的表达量在3h时达到峰值，随后表达量下降(如图2)。三、利用巨噬细胞炎症模型评价化合物的抗炎效果(所有检测试剂购于Promega 公司)
1、 将分离所得的转基因小鼠巨噬细胞以104个/孔接种于96孔板中，37 °C培 养60h。
2、 将细胞分为a、 b、 c三组。在a组细胞培养液中加被筛选化合物，b组细 胞培养液中加安慰剂(例如酵母聚糖)，置于培养箱中培养30min。
3、 在a、 b组细胞中加入炎症激发因子，诱导若干小时。c组细胞为空白对 照组。
4、 吸去三组细胞的培养液，用PBS洗2遍。
5、 加入lxCCLR50ul/孔覆盖细胞，反应10分钟。
6、 充分吹打细胞，将裂解后的液体移入离心管，12,000xg离心15s。
7、 将40ul细胞抽提液与100ul的Luciferase Assay Reagent (室温平衡)用 枪头混匀。
8、 将管子放入PCT半自动定量分析仪Luninometer中，检测荧光值。
9、 评价化合物的抗炎效果。化合物对炎症反应的抑制率定义为(l-a样品的 荧光值/b样品的荧光值)xlOO%。
荧光素酶报告基因表达水平的变化可反映被筛选化合物对人白细胞介素1(3 基因表达的抑制情况。也就是说在巨噬细胞炎症模型中，加药组a与对照组b中 荧光素酶基因表达水平的差异可用来评价该化合物针对人白细胞介素1|3基因耙 点的抗炎效果。 实施例
地塞米松是一种具有抗炎、抗内毒素及增强应激反应等药理作用的皮质激素 类药物。在炎症反应中地塞米松可调节炎症介质和细胞因子的释放。我们利用 IL-luc转基因小鼠巨噬细胞炎症模型评价地塞米松的抗炎效果。
1、 将分离所得的转基因小鼠巨噬细胞以104个/孔接种于96孔板中。细胞培 养60h后，加地塞米松于细胞培养液内，使其终浓度为lpM。然后将细胞放于 37 °C ， 5 % C02培养箱中培养30min。
2、 细胞培养液中分别加入LPS或酵母聚糖使其终浓度分别为100ng/ml或 125吗/ml，置于37'C， 5% C02培养箱中培养3h。
3、 吸去培养液，以PBS洗涤细胞2次。
4、 每孔细胞加入50^1 CCLR裂解细胞。
5、 充分吹打细胞，将裂解后的液体移入离心管，12,000xg离心15s。
6、 将40ul细胞抽提液与100ul的Luciferase Assay Reagent (室温平衡)用 枪头混匀。
7、 将管子&AJ ,iminometer中，检测荧光值f
结果如图4、 5所示，在LPS或酵母聚糖诱发的巨噬细胞炎症模型中，地塞 米松可显著地(P<0.05， ！1=3 =抑制人白细胞介素1(3基因启动子驱动的荧光素 酶基因的表达。
权利要求
1. 一种用于抗炎药物筛选的细胞模型，是原代培养的人白细胞介素1β启动子驱动荧光素酶报告基因转基因小鼠腹腔巨噬细胞，该细胞中含有报告基因表达盒，该表达盒从5’到3’端依次含有以下元件炎症相关因子的启动子，荧光素酶基因，PolyA信号。
2. 根据权利要求l所述的细胞模型，其特征在于所述炎症相关因子的启动子选自IL-1(3启动子、IL-la启动子、TNF-a启动子、IL-6启动子。
3. 根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于所述炎症相关因子的启动子 是人白细胞介素1P启动子或称作IL-ip启动子。
4. 一种用于抗炎药物筛选的试剂盒，其特征在于含有权利要求1或2或3所 述的腹腔巨噬细胞和炎症激发因子；所述炎症激发因子选自脂多糖LPS、酵 母聚糖、IL-la、 TNF-a、 IL-6、唑酮、病原微生物及其代谢产物。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中单孔细胞量为1.0-9.9 x 104 个腹腔巨噬细胞，每孔RPMI-1640培养基为lOOpl;使用脂多糖时，LPS的 终浓度范围为20ng/ml-2吗/ml，优选80-120 ng/ml;使用酵母聚糖时，酵母 聚糖的浓度范围为50ixg/ml-500^ig/ml，优选100-150吗/ml。
6. —种利用巨噬细胞炎症模型筛选抗炎药物的方法，包括1) 分离并原代培养人白细胞介素1P启动子驱动荧光素酶报告基因IL-Iuc转 基因小鼠的腹腔巨噬细胞;将分离所得的转基因小鼠巨噬细胞以1.0-9.9 x 104 个/孔接种于％孔板中，37 °C培养50-70h;2) 在细胞培养液中加入待筛选的化合物，放于37'C， 5%C02培养箱中培 养20-60min;3) 细胞培养液中加入炎症激发因子，诱导若干小时，利用炎症激发因子激 发巨噬细胞炎症的发生；洗涤后测定报告基因的表达水平，评估化合物的抗 炎效果。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于炎症激发因子包括脂多糖LPS、 酵母聚糖、IL-la、 TNF-a、 IL-6、唑酮、病原微生物及其代谢产物。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于其中单孔细胞量为1.0-9.9 x 104个腹腔巨噬细胞，每孔RPMI-1640培养基为IOO叫使用脂多糖时，LPS 的终浓度范围为20ng/ml-2吗/ml，优选80-120 ng/ml;使用酵母聚糖时，酵 母聚糖的浓度范围为5(Htg/ml-50(Hig/ml，优选100-150吗/ml。
9. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于用荧光素酶报告基因的表达 水平来反映人白细胞介素lp的表达水平；以被筛化合物抑制荧光素酶报告 基因表达的程度来评价该待筛选化合物针对人白细胞介素1|3靶标的抗炎效 果。
全文摘要
本发明建立了一种以人白细胞介素1β基因为靶标的高效、可靠的抗炎药物筛选原代细胞模型及筛选方法。本发明分离并原代培养了一种导入了人白细胞介素1β启动子驱动荧光素酶报告基因表达的转基因小鼠的腹腔巨噬细胞，经炎症激发因子诱导建立了巨噬细胞炎症模型。在该模型中可通过测定被筛选化合物抑制报告基因表达的程度来评价化合物的抗炎活性。本发明所建立的药物筛选模型是一种灵敏、高效、可靠、适于高通量抗炎药物筛选的细胞模型。
文档编号C12N5/10GK101463343SQ200810205078
公开日2009年6月24日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者李利妹, 王铸钢, 华 荆, 俭 费 申请人:同济大学;上海南方模式生物科技发展有限公司