专利名称：：miR-21反义寡聚核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及反义核酸及其应用，尤其涉及miR-21的反义核酸及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：研究发现，microRNAs(又称为miRNAs或微小核酸)与多种疾病的发生和发展密切相关。在众多疾病中，恶性肿瘤的miRNA表达异常最受瞩目。Berezikov等(BerezikovE,GuryevV,vandeBeltJ,etal.PhylogeneticshadowingandcomputationalidentificationofhumanmicroRNAgenes.Cell,2005，120(1):21-24)通过计算机分析显示30%以上的蛋白编码基因可能成为miRNA的耙基因。Calin等(CalinGA，SevignaniC，DumitruCD,etal.HumanmicroRNAgenesarefrequentlylocatedatfragilesitesandgenomicregionsinvolvedincancers.ProcNatlAcadSdiUSA,2004,101(9):2999-3004)研究显示，50%的miRNAs位于肿瘤相关基因组的区域或者脆弱位点，提示miRNAs可能在部分肿瘤发生中发挥了人们原来所不了解的重要作用。最早人们对于miRNAs参与肿瘤发生发展的证据来自'人慢性淋巴细胞白血病(CalinGA，D咖itruCD,ShimizuM，etal.Frequentdeletionsanddown-regulationofmicro-RNAgenesmiR15andmiR16at13ql4inchroniclymphocyticleukemia.ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(24):15524-15529)，研究者发现定位于13ql4的miR-15a和miR-16a在50%慢性淋巴细胞白血病患者中缺失或者表达下降。之后Ci咖ino(CimminoA,CalinGA,FabbriM,etal.miR-15andmiR_16induce即optosisbytargetingB(X2.ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(39):13944-13949)的研究显示，Bcl_2是miR-15a和miR-16a的靶基因。miR-15a和miR-16a的表达水平与慢性淋巴细胞白血病中Bcl-2的表达水平密切相关，这两个miRNAs可以从转录后水平负性调控Bcl-2的表达，这一研究同时也为白血病的细胞模型il供了依据，提示miR-15a和miR-16a可以被用来治疗过度表达Bel-2的肿瘤。3根据高通量的miRNA微阵列和QRT-PCR的定量分析，发现在多种人类恶性肿瘤中，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等的miRNA表达谱与它们来源的正常组织存在很大区别，这种区别在低分化和恶性程度高的肿瘤组织表现得更显著些(AlvarezGarciaI，MiskaEA.MicroRNAfunctionsinanimaldevelopmentandhumandisease.Development,2005'132(21):4653-4662;WakiyamaM'TakimotoK'Ohara0,etal.Let-7microRNA-鹏diatedmRNAdeadenyiationandtranslationalrepressioninamammalianceli-freesystem.GenesDev,2007,21(15):1857-1862;MengF，HensonR，LangM，etal.Involvementofhumanmicro-RNAingrowthandresponsetochemotherapyinhumancholangiocarcinomacelllines.Gastroenterology,2006，130(7):2113-2129)。总的来说，恶性肿瘤的miRNA总体含量比来源的正常组织明显降低，肿瘤分化越差，miRNA的含量也越低。此外，具体到每一种恶性肿瘤，都发现有几种miRNA的表达明显低于其来源的正常组织。在乳腺癌组织中，miR-10b、let-7、miR-125b和miR-145等miRNA的表达明显下调。另一方面，某些miRNA在肿瘤组织内的表达却有所上升，如乳腺癌的miR-155(Couzin,J.Cancerbiology.Anewcancerplayertakesthestage.Science,2005，310:766-767)。恶性肿瘤miRNA表达的变化说明肿瘤细胞基因调控机制发生改变，与cDM微阵列比较，tniRNA表达谱能为癌肿的分子分期和分型提供更准确的信息(LuJ,GetzG，MiskaEA，etal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhu画cancers.Nature,2005，435(7043):834-838)。那么，表达水平发生变化的miRNA是否参与了恶性肿瘤的发生和发展？虽然目前对该问题的研究还'处在初始阶段，但是根据生物信息学的预测和现有的实验研究结果，发现在癌细胞中表达异常的miRNA的靶基因属于癌基因或者抑癌基因，这些靶基因都与细胞的增殖、凋亡或分化密切相关。.正是因为miRNA具有调节癌基因或者抑癌基因表达的功能，故其自身也充当着"抑癌基因"和"癌基因"的角色(ChenCZ.MicroRNAsasoncogenesandt咖orsuppressors.NEnglJMed,2005,353(17):1768-1777;IorioMV'FerracinM，LiuCG,etal.MicroRNAg,expressionderegulationinhumanbreastcancer.CancerRes,2005,65(16):7065-7070;CaldasC，BrentonJD.SizingupmiRNAsascancergenes.NatMed，2005，11(7):712-714;ZhangB,PanX,CobbGP，etal.microRNAsasoncogenesand.tumorsuppressors.DevBiol,2007,302(1):1-12;HammondSM.MicroRNAsastumorsuppressors.NatGenet,2007,39(5):582-583;HuangQ，GumireddyK，SchrierM，etal.ThemicroRNAsmiR-373andmiR-520cpromotetumourinvasionandmetastasis.NatCellBiol,2008，10(2):202-210;SchulteJ"H,HornS,OttoT,etal.MYCNregulatesoncogenicMicroRNAsinneuroblastoma.IntJCancer,2008,122(3):699-704;EsquelaKerscherA，SlackFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer.NatRevCancer,2006，6(4):259-269)。目前在动植物中已发现数以千计的miRNAs，其中只有少数miRNAs功能得到了确定，而绝大部分还是未知。相对于其他生物，人类raiRNAs功能的研究更为复杂。miR-21是较早发现的人类mi認A之一，因其较为明确的存在背景，而成为人类niiRNAs功能研究中的重要工具，miR-21在哺乳动物多种组织中的广泛存在，对其生物学发生、作用机制的研究方法更具普遍意义。当miR-21作为工具来研究人类miRNAs作用机制和功能的同时，miR-21自身的功能研究也得到了更进一步的深入，其中最为突出的成果表现在miR-21与肿瘤的关系。miR-21是由两个实验室分别独立发现的。2001年，Lagos等(LagosQuintanaM，RauhutR，LendeckelW，etal.IdentificationofnovelgenescodingforsmallexpressedRNAs.Science,2001，294(5543):853-858)证实了在非脊椎动物和脊椎动物中存在类似于Lin4和Let-7的小RNA，其中已经包括miR-21。此后，Mourelatos、Dostie等(MourelatosDostieJ，PaushkinS，etal.miRNPs:anovelclassof'ribonucleoproteinscontainingnumerousmicroRNAs.GenesDev，2002,16(6):720-728;DostieJ，MourelatosZ,YangM.，etal..NumerousmicroRNPsinneuronalcellscontainingnovelmicroRNAs.RNA,2003,9(2):180-186)从人类和小鼠的神经元细胞以及人类宫颈癌细胞系HeLa细胞中分别检测到了miR-21。2005年，Fu等(FuH，TieY，XuC,etal.IdentificationofhumanfetallivermiRNAsbyanovelmethod.FEBSLett,2005,579(17).:3849-3854)的研究提示，许多miRNAs参与了肝细胞的基因表达，采用实时定量PCR方法验证了在胚胎肝组织中存在50种miRNA，miR-21又是其中之一。2005年，'Volinia等(VoliniaS，CalinGA，LiuCG，etal.Amicro腿expressionsignatureofhuman.solidtumorsdefinescancergenetargets.ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(7):2257-2261)采用基因芯片技术賴耙位点预测数据库，对不同系统肿瘤中miRNAs表达谱进行研究，列出了miRNA在不同系统中表达升高或降低的谱，并绘出了与其对应的靶基因谱。有趣的是，研究者将在多种肿瘤中都表达升高的miRNA进行归纳，发现miR-21在几种肿瘤中都是表达升高的。Schmittgen等发现，在HeLa细胞和结肠癌细胞系(HCT-116)中，miR-21明显高表达，而在前髓细胞性白血病细胞(HL-60)、慢性髓细胞白血病细胞(K562)、前列腺癌细胞(LNCAP)中表达相对较低。Iorio等(IorioMV，FerracinM，LiuCG,etal.MicroRNAgeneexpressionderegulationinhumanbreastcancer.CancerRes,2005，65(16):7065-7070)比较了乳腺癌及正常乳房组织miR-21的表达，通过微点阵和Northernblot验证了miR-21在乳腺癌组织中的表达上调，表明miR-21可能在乳腺癌恶性肿瘤形成中也扮演着癌基因的角色。Ciafre等(CiafreSA，GalardiS,MangiolaA，etal.ExtensivemodulationofasetofmicyoRNAsinprimaryglioblastoma.BiochemBiophysResCommun，2005，334(4):135W358)利用微点阵的分析方法检测了245种ndRNAs的整体表达水平，鉴定了一组在高度恶性的原发性脑组织肿瘤中其表达谱发生改变的miRNAs，其中miR-21在恶性胶质瘤中的表达大幅度上调，而miR-128、miR-181a、miR-181b以及miR-181c表达下调。Chan等(ChanJA，KrichevskyAM,KosikKS,etal.MicroRNA-21isanantiapoptoticfactorinhumanglioblastomaceils.CancerRes,2005,65(14):6029-6033)通过对原代多形性恶性胶质瘤细胞体外建立的6种恶性胶质瘤细胞系(A172、U87、11373、LN229、LN428、LN308)与正常胎儿及成人脑组织以及体外培养的正常神经胶质细胞的比较分析，也发现在恶性胶质瘤中miR-21的表达水平明显升高，进一歩研究表明，在培养的恶性胶质瘤细胞中下调miR-21的表达，可以触发Caspases的激活，进而导致肿瘤细胞的凋亡。这些研究表明异常表达的miR-21可能通过抑制关键性的凋亡相关基因表达而促进恶性肿瘤的形成。近三十年，尽管临床上肿瘤的综合治疗已很普遍，但以手术为主，放化疗为辅的综合治疗对肿瘤患者的生存率提高并不明显，5年总体生存率仍然较低，徘徊在30%55%左右，并没有显著提高，中晚期患者的5年生存率更低，约为20%。而且这些方法都存在各自的局限性，特别是对中晚期和复发患者疗效不佳，对伴有远处转移者疗效更差。因此，寻找更安全有效的治疗途径是提高肿瘤患者生存率和生存质量所亟待解决的难题。
发明内容本发明要解决的主要问题就是提供一组能够抑制miR-21表达的反义核酸。本发明要解决的另一问题就是提供上述反义核酸在肿瘤细胞中抑制miR-21表达和抑制细胞生长和增殖的应用。为解决上述问题，本发明设计并合成了一系列针对miR-21不同区域的长度不同的反义核酸，并在培养细胞中验证具有抑制效果的反义核酸。研究显示，这些反义核酸能够抑制肿瘤细胞的生长、恶'改增殖能力和侵袭能力。本发明设^了一系列可以结合于miR-21不同位置的反义核酸分子，在培养细胞SSC-15和CAL27中，验证对miR-21表达特异性抑制的反义核酸对细胞生长能力、增殖能力、迁移能力和凋亡能力的影响，反义核酸分子长度可以包含12~22个核苷酸残基，均有不同程度的抑制人肿瘤细胞生长能力、增殖能力、迁移能力和凋亡能力的特性，其中最短的反义核酸长度为12个碱基，不同长度的反义核酸均具有良好的肿瘤细胞生长及增殖抑制活性。因此，上述反义核酸均可用来制备抑制肿瘤细胞生长能力、增殖能力、迁移能力和凋亡能力的制剂，其中优选miR-21高表达的肿瘤细胞。从目前来看，核酸杂交中RNA与miRNA的杂交亲和力比DNA与miRNA杂交的亲和力要高，具有很高的药用价值。但是人工合成的DNA成本远远比合成RNA的成本低，也具有很好的市场潜力。而且也可以采用核糖RNA单体与脱氧核糖DNA单体嵌合相连而成的反义核酸作为药物进行开发。本发明设计的一系列反义核酸分子，既包括DNA分子，也包括柳A分子，两种分子均具有抑制miR-21表达的活性。本发明设计的反义核酸，其序列具有特异性生物学活性，其对于某一基因互补的位点的反义核酸所互补的长度有很大关系，如互补的长些，则生物学活性会更高些，抑制效果也会更好一些，在增加或减少一个至数个碱基而互补与同一基因位点的反义核酸，同样也具有不同程度的生物学活性，也可达到不同程度的抑制肿瘤细胞生^:与增殖的作用，本发明的研究表明，最短可达12个碱基仍然具有抑制miR-21表达的作用。反义核酸研究中，各种化学修饰方法很多。本发明采用硫代修饰的反义核酸，主要是硫代的反义核酸的药理学、药代动力学、毒理学等临床前研究是各种化学修饰反义核酸中研究最为全面的，硫代反义核酸在体内可以有效地防止人体内大量核酸外切酶对反义核酸的酶切而降解，从而使反义核酸失去应由的生物学活性。此外硫代反义核酸还可激发RNA酶的活性，降解与其杂交的RNA链，因此优选硫代的反义核酸在实验中应用。应当明确的是，任何能够增加反义核酸稳定性和生物利用度的修^P方法都可以应用，如甲氧修饰、胆固醇修饰等。本发明的上述反义核酸具有抑制miR-21表达的效果。当将上述反义核酸转染到miR-21高表达的细胞株SSC-15和CAL27中后，能够有效抑制肿瘤细胞的生长和恶性增殖能力，并能促进细胞凋亡。图1转染前后舌鳞癌细胞SSC-15和CAL27凋亡变化转染miR-21AS后，舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27凋亡增加，出现明显的凋亡峰，而转染lin4AS0后凋亡无明显变化。具体实施例方式下面将结合实施例及附图进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。实施例1反义核酸对miR-21表达的抑制作用.采用本发明设计并合成的针对miR-21的反义核酸(以下简称miR-21AS)，反义核酸分子的编号和序列(经过全硫代修饰)如下AS05'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'(针对miR-21全长的反义RNA序列)AS15'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，(针对miR-21全长的反义DNA序列)AS35'-AGUCUGAUAAGCUA-3'(针对miR-215'端的14个碱基的反义RNA序列)AS55'-UCAACAUCAGU03'(针对miR-213，端的12个碱基的反义RNA序列).AS65，-TCAACATCAGTCTG-3，(针对miR-213，端的14个碱基的反义DNA序列)AS75'-ACAUCAGUCUGAUAAGC-3'(针对miR-21中间区域的17个碱基的反义RNA序列)对照lin4AS0的序列为5，-UCACACUUGAGGUCUCAGGGA-3，将上述反义核酸序列转染到miR-21高表达的舌鳞癌细胞株SCO15和CAL27中.-1)转染前一天，在24孔板中用适量不含抗生素的培养基接种培养细胞，使转染时细胞的汇合度达到3050%;2)转染样品按照如下方法准备寡聚物-Lipofectaraine2000复合物a,用50ul不含血清的Opti-MEMI培养基分别稀释30pmolmiR-21ASO、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7和30pmolUMASO,轻轻混匀；b,使用前轻轻混匀Lipofectamine2000，然后取2w1稀释到50w1的Opti-MEMI培养基，轻轻混匀后在室温下孵育5min;c,孵育5n]in后，稀释的LipofectamineTM2000分别与稀释的miR-21ASO、lin4ASO和TPM-1-siRNA混合，轻轻混匀后在室温下孵育20inin，以允许复合物的形成；3)将复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，轻轻地前后摇动培养板混合，4)37°C，5%(:02培养箱孵育过夜，更换含10W胎牛血清的培养基继续培养48h，进行后续基因阻断分析。以miR-21..AS分别转染SCC-15和CAL2^细胞，以未转染miR-21AS的细胞和转染lin4ASO的细胞作为对照组(设立转染lin4AS0组是为了排除miR-21ASO的脱靶效应)，采用qRT-PCR检测miR-21表达。结果可见，转染miR-21AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-,21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7后，tniR-2i的表达显著低于未转染raiR-21AS的细胞，而转染lin4-SO对miR-21的表达未见显著影响。总RNA及miRNA的提取(tnirVanamicroRNA提取试剂盒，购自Ambion)::1)加入600ulLysis/BindingSolution,裂解组织；2)加入1/10裂解液体积的microRNAHomogenateAdditive,混匀，冰上放置10min;'3)加入与裂解液(未加microRNAHomogenateAdditive)等体积的酚氯仿溶液，混匀，10,000Xg室温离心5min;4)将上清夜移到干净的管子中，并记下液体的体积；5)加入l/3上清夜体积的100%酒精，彻底混匀；6)将裂解液/酒精的混合物加入到FilterCartridge柱中，10,OOOXg离心15s，收集滤液；7)FilterCartridge柱上保留的主要为大分子RNA，按照总RNA提取的标准流程回收保留的RNA用于对样品保存质量的判断；8)向滤液中加入2/3体积的100%酒精(室温)，混匀；9)将混匀的液体加入新的FilterCartridge柱中，10，000rpm离心15s，弃滤液，重复利用收集管；10)加入700ulmicroRNAWashSolution1，10,000rpm离心510s，弃滤液，重复利用收集管；11)加入500ulWashSolution2、3，10,000rpm离心510s，弃滤液，重复洗涤一次；12)10，000g空离心lmin，以去除滤膜中残余的液体；13)将FilterCartridge柱移到干净的管子屮，加入100ul预热到95。CElutionSolution或Nuclease-freeWater到滤膜中间，最大速度离心2030s，收集滤过液，重复上述步骤一次，合并两次的收集液；14)收集的样品用于后面的实验或保存于-2(TC或更低的温度下。miR-21的荧光实时定量PCR由上海吉玛制药技术有限公司检测。表1转染miR-21AS前后SCC-15和CAL27细胞中的miR-21表达变化(设定转染前表达量为1，表格中数字为转染48小时后表达量与转染前的比值)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>F(miR-21AS6)0.0812±0.02980.0927±0.0362G(miR-21AS7)0.0761±0.04340.0914±0.0302H(lin4ASO)0.2974±0.07910.2942±0.1233卖施例2MTT^^测细胞存活率采用MTT实验检测转染miR-21ASO、TPM-;fsi柳A前后舌鳞癌细胞存活率的变化，结果显示，分别转染miR-21:AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、raiR-21AS6、miR-21AS7后舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27存活率比转染miR-21ASO前明显降低；而转染lin4ASO后细胞存活率无明显变化1)收集转染后的舌鳞癌细胞分别接种于96孔板，约5X10'个/L，置37"、5%0)2温箱培养。2)计算转染后72h,去除96孔板每孔中培养液，每孔加入180yl新鲜DMEM培养液，.再加入20"1MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h。3)终止培养，去除孔内培养液。每孔加入IOOyl二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。4)在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值表2转染miR-21AS前后SCC-15和CAL27细胞存活率变化Groupsmean土SD(%)SCC15CAL27A(raock)0.857±0.0570.830±0.080B(raiR-21ASO)0.447±0.0780.390±0.099C(miR-21AS1)0.512±0.0690.467±0.074D(tniR-21AS3)0.472±0.0810.473±0.066E(miR-21AS5).0.507±0.0690.508±0.037F(miR-21AS6)0.517±0.0450.497±0.032G(miR-21AS7)0.493±0.0720.429±0.046H(lin4ASO)0.837±0.0570.813±0.031实施例3克隆形成实验检测细胞恶性增殖能力通过克隆形成实验检测转染miR-21AS0、TPM-1siRNA前后舌鳞癌细胞的增殖能力变化。结果显示，分别转染miR-21AS0、miR-21ASl、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7后舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27克隆形成率比转染miR-21反义核酸前明显降低，差异有显著性；而转染lin4ASO后细胞克隆形成率无明显变化'1)舌鳞癌细胞转染后接种于平底6孔培养板中，400个细胞/孔，晃动培养板使细胞分布均匀，置37'C、5%0)2温箱培养。2)当培养板中出现肉眼可见的克隆时中止培养，弃培养液，PBS洗2次。3)纯甲醇5ml固定15min。4)弃固定液，加适量姬姆萨应用染色液染色1030niin，流水缓慢洗去染液，室温干燥。5)显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。6)克隆形成率的计算克隆数/接种细胞数X100X表3转染miR-21AS前后SCC-15和CAL27细胞克隆形成率变化Groupsme加士SD(%)SCC-15CAL27A(mock)88.67土4.1693.67±10.60B(miR-21ASO)63.33±7.5768.67±8.15C(miR-21ASl)64.29±8.3165.17±6.06D(miR-21AS.3)70.62±6.2969.75±5.85E(miR-21AS5)68.53±5.6972.09±6.23F(miR-21AS6).71.65±7.1774.62±7.33G(miR-21AS7),66.58±4.9270.59±9.62H(lin4AS0)89.67±6.1195.67土10.97实施例4软琼脂集落形成实验检测细胞侵袭能力通过软琼脂集落形成实验检测转染miR-21AS0、TPM-1siRNA前后非锚着依赖性生长的舌鳞癌细胞的侵袭能力。结果显示，分别转染miR-21AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7后非锚着依赖性生长的舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27集落形成率比转染miR-21AS0前明显降低，差异有显著性；而转染lin4AS0后细胞集落形成率无明显变化。1)舌鳞癌细胞SSC-15和CAL27转染miR-21AS24h后，收集细胞制成细胞悬液，调整细胞密度至lX10Vml。'2)制备底层琼脂(0.6%):取6%琼脂置于沸水浴中使其完全溶化，取出一份6^琼脂待冷至约5(TC，加入9份预热37。C的新鲜培养液，混匀后加入12孔培养板中，室温凝固备用。.3)制备上层琼脂(0.35%):取37'C保温的细胞悬液9.4ral，加入5(TC的6%琼脂约0.6ml，混匀后加入铺有底层琼脂的12孔板中，细胞数约100200个/孔。'4)置培养板于37°C、5%0)2温箱培养，待肉眼可见的球状集落形成时中止培养。5)把培养板放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计数大于50个细胞的集落数。6)集落形成率的计算集落数/接种细胞数XlOOX表4转染miR-21AS前后SCC-15和CAL27细胞软琼脂集落形成率变化Groupsmean士SD(%)SCC-15CAL27A(mock)95.07±8.1092.00±4.58B(miR-21AS0)'35.00±11.5333.00±7.81C(miR-21AS1)肌13±6.6736.29±8.62D(miR-21AS3)36.83±7.4139.67±10.07E(raiR-21AS5)38.42±10.7540.29±6.74F(miR-21AS6)42.69±9.8433.85±9.42G(miR-21AS7)37.90±9.4334.88±5.97C(lin4AS0)98.00±14.1887.67±8.51实施例5转染.miR-21AS后细胞凋亡情况检测将AnnexinV进行荧光素FITC标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪检测转染miR-21AS0、miR-21AS1、miR-21AS3、miR-21AS5、miR-21AS6、miR-21AS7前后舌,癌细胞SSC-'15和CAL27的凋亡情况。结果显示，舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27转染miR-21反义核酸后，凋亡明显增加，而转染lin4AS0后凋亡无明显变化(图l)。1)消化、收集培养的舌鳞癌细胞，调整细胞数目约lXl(T个/mL，取lml细胞悬液，1000rpm4。C离心10min，弃去培养液。2)加入1ml冷PBS重悬细胞，1000rpm4"C离心10min，弃上清。细胞重悬于200y1结合缓冲液。4)加入IOulA皿exinV-FITC和5y1PI，,轻轻混匀，避光室温反应15min。5)加入300Pl结合缓冲液，立即采用流式细胞仪检测分析，结果见图l。实施例6制备抑制肿瘤细胞生长能力、增殖能力、迁移能力的制剂1)用50y1不含血清的Opti-MEMI培养基分别稀释30pmol反义寡聚核驟，轻轻混匀；2)使用前轻轻混匀Lipofectamine2000，然后取2ul稀释到50"1的Opti-MEMI培养基，轻轻混匀后在室温下孵育5min;3)孵育5min后，稀释的Lipofectamine2000分别与稀释的反义寡聚核酸混合，轻轻混匀后在室温下孵育20min，复合物形成。所述复合物用于抑制肿瘤细胞生长能力、增殖能力、迁移能力等。权利要求1、针对人miR-21的一组反义寡聚核苷酸，其包括与下述核苷酸序列中至少12个连续的核苷酸互补的序列5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。2、如权利要求1所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于可特异性结合于人miR-21的不同区域。3、如权利要求1或2所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于核苷酸为核糖核苷酸。4、如权利要求1或2所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于核苷酸为脱氧核糖核苷酸。5、如权利要求广4所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于具有以下序列，5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'5'-AGUCUGAUAAGCUA-3'5'-UCAACAU(;AGUC-3''5'-TCAACATCAGTCTG-3'5'-ACAUCAGUCUGA11AAGC-3'6、权利要求广5中任一反义寡聚核苷酸序列的修饰型。7、如权利要求6所述的反义寡聚核苷酸的修饰型，其特征在于所述修饰方式为硫代修饰。8、如权利要求6所述的反义寡聚核苷酸的修饰型，其特征在于所述修饰方式为甲氧修饰。9、根据权利要求广8中任一反义寡聚核苷酸序列在制备治疗raiR-21高表达的肿^的药物中的应用。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述miR-21高表达的肿瘤为舌鳞癌。全文摘要本发明公开了一组用于抑制舌鳞癌中miR-21表达的反义寡聚核苷酸及其应用。本发明所述的反义寡聚核苷酸，包括与下述核苷酸序列中至少12个连续的核苷酸互补的序列5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，上述互补序列可特异性结合于人miR-21的不同区域。本发明的反义寡聚核苷酸可以为核糖核苷酸，也可以为脱氧核糖核苷酸，并可以对任一核苷酸进行修饰。本发明所述的具有抗舌鳞癌作用的miR-21反义寡核苷酸能够有效抑制舌鳞癌细胞SSC-15和CAL-27中miR-21的表达，同时抑制上述两种细胞的生长和增殖，促进细胞凋亡，从而能够有效地治疗舌鳞癌及其他miR-21高表达的肿瘤。文档编号C12N15/113GK101457224SQ20081020472公开日2009年6月17日申请日期2008年12月17日优先权日2008年12月17日发明者宋尔卫,张佩琢,李劲松申请人:苏州吉玛基因药物科技有限公司;李劲松;宋尔卫