专利名称：miRNA-23a反义核苷酸在制备用于治疗心脏病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新用途，尤其涉及一种miRNA-23a反义核苷酸在治疗心脏疾病中的用途，属于生物制药技术领域。
背景技术：
心血管疾病主要包括高血压、冠心病、充血性心力衰竭等。目前，心血管疾病仍然是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。毫无疑问，预防和治疗心血管疾病仍然是医学与生物学的重大任务。心肌肥大是指组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大的总称。它是由于心肌细胞体积增大而导致心脏体积增大所发生的一种疾病。该病是由一些生理和病理因素的共同刺激而发生的，它是许多心血管疾病的综合性表现。心肌肥大是心肌病的一种，是心肌细胞针对于血液动力学增加的一种应答反应。多种情况可以引起人体内血液动力的增加，比如高血压，心脏瓣膜疾病。长期的超负荷血液动力刺激会引起以心肌细胞体积增大为特征的心肌细胞重塑过程，也就是心肌肥大。现在一般认为存在两种情况的心肌肥大，一种是正常的生理性肥大，比如出生后伴随者发育发生的心肌肥大，还有体育锻炼引起的心肌肥大；另外一种是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室间隔增厚，心肌收缩功能增强，因此被视为代偿性肥大，如果病情一直未得到缓解，心肌肥大后期会发生心室壁间质纤维化、心肌细胞收缩功能失调以及能量代谢，基因表达和电生理特征的异常，最终导致心脏功能衰竭。鉴于心肌肥大的发生是一个进行性不可逆过程，而且最终会引起心力衰竭，现代医学已经把它作为心脏发生临床病变的一个里程碑式的心肌形态变化，认为它是导致心脏疾病和心脏猝死的一个危险因素。随着近来miRNA研究的热潮，这种内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程。对于miRNA来说，它调控方式的特点决定了它的靶基因不会只有一个，而是一对多的方式，这就是使得miRNA的功能研究内容非常丰富。许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。尽管越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，但在心脏肥厚和心肌纤维化心脏疾病中的关键miRNA仍没有确定，其所发挥的功能是对该领域科研人员的挑战。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种miRNA-23a反义核苷酸在制备用于诊断、预防或治疗心脏疾病药物中的用途，确定或发现调控心肌细胞肥大的在心脏中表达的miRNA，进一步确定其在心肌肥厚、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。针对上述目的，本发明的技术方案如下一方面，本发明提供一种miRNA-23a的反义核苷酸在制备用于诊断、预防或治疗心脏疾病药物中的用途。优选地，所述miRNA_23a的核苷酸序列如下述SEQ ID NO 1的序列所示5' -GGAAAUCCCUGGCAAU⑶GAU-3‘。优选地，所述心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病及心衰。另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物由有效量的miRNA-23a反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料组成。优选地，所述载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体。再一方面，本发明提供一种药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途。优选地，所述心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病及心衰。本发明通过实验发现miRNA_23a(其核苷酸序列如SEQ ID NO :2序列的所示 5' -AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3 ‘)在肥大的心肌细胞和心脏肥厚中表达显著上调。通过构建miRNA-23a过表达腺病毒或miRNA_23a转基因小鼠加强miRNA_23a的表达，发现 miRNA-23a过表达在细胞水平能诱导心肌细胞肥大的发生，miRNA-23a的转基因小鼠的心脏在用肥大刺激因子处理后与对照组相比有了明显的肥大表型及纤维化程度，同时一些肥大基因的表达也与对照组相比有了明显的增加。具体的，本发明发现miRNA-23a在肥大的心肌细胞中与对照组相比有了明显的提高，对其进行肥大指标的检测发现，心肌肥大的指标如细胞表面积，蛋白/DNA的比值及肌小节的重组也与对照组相比都有了明显的增加。miRNA-23a的转基因小鼠在用肥大刺激因子(苯肾上腺素)后的心脏表型，心脏体重比，边缘区的心肌细胞横截面积(WGA染色)及心肌纤维化(Masson染色)与野生型相比都有了明显的增加。以上实验说明miRNA-23a能够诱导心肌肥大的发生，这意味着miRNA_23a可作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。另外，本发明通过大量的试验证明miRNA-23a的反义核苷酸对心肌肥厚，心肌纤维化具有保护作用。具体的，本发明在细胞水平通过转染miRNA-23a的反义核苷酸发现， 它能够抑制肥大刺激因子所诱导的心肌细胞肥大，包括肥大指标如细胞表面积，蛋白/DNA 的比值及肌小节的重组也与对刺激组相比都有了明显的降低。在动物水平通过注射外源 miRNA-23a的反义核苷酸也能够抑制肥大模型的肥大效应包括心脏表型，心脏体重比，边缘区的心肌细胞横截面积(WGA染色)及心肌纤维化(Masson染色)都有了明显的降低，同时心功能也有了明显的改善。以上实验说明miRNA-23a的反义核苷酸通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可成为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。具体的，可以合成反义miRNA-23a的反义核苷酸并与适当载体如胆固醇，纳米颗粒，脂质体等连接形成药物，通过口服，静脉或肌肉注射的方式，心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病进行治疗。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1为miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的表型及心脏的比较试验结果示意图，图中A为miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的表型及心脏体重比的比较试验结果示意图；B为miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的心脏功能的比较的试验结果示意图；图2为在苯肾上腺素(PE)刺激下，miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的表型及心脏比较试验结果示意图，图中A为在PE刺激下，miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的表型及心脏体重比的比较试验结果示意图；B为在PE刺激下，miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的心脏功能的比较的试验结果示意图；图3为PE和内皮素(ET-I)诱导的心肌细胞肥大过程中miRNA_23a表达水平的变化结果示意图，图中A为小鼠原代心肌细胞经PE诱导处理后miRNA-23a的表达水平试验结果示意图；B，小鼠原代心肌细胞经ET-I诱导处理后miRNA-23a的表达水平试验结果示意图；图4为原代心肌细胞转染miRNA-23a反义核苷酸后的试验结果示意图，图中A为原代心肌细胞转染miRNA-23a反义核苷酸后心肌细胞的表面积被抑制的试验结果示意图； B为原代心肌细胞转染miRNA-23a反义核苷酸后心肌细胞的蛋白/DNA被抑制的试验结果示意图；C为原代心肌细胞转染miRNA-23a反义核苷酸后心肌细胞的肌小节重组的试验结果示意图；图5为小鼠静脉注射miRNA-23a反义核苷酸(antagomir)能抑制PE所诱导的肥大模型的检测结果示意图，图中A为心脏表型的检测结果示意图；B为心肌细胞横截面积(WGA 染色)的检测结果示意图；C为心脏体重比的检测结果示意图；图6为小鼠静脉注射miRNA-23a反义核苷酸(antagomir)能抑制主动脉缩窄 (TAC)所诱导的小鼠心脏肥大模型的检测结果示意图，图中A为心脏表型的检测结果示意图；B为心脏体重比的检测结果示意图；C为心肌细胞横截面积(WGA染色)的检测结果示意图。
具体实施例方式以下实验小鼠除特殊说明外，均购自北京医科大学，品系均为C57/BL6。实施例1 miRNA-23a转基因小鼠的表型及心脏功能与野生型相比没有明显的改变miRNA-23a转基因小鼠(购自沈阳医学院)与野生型小鼠(购自北京医科大学) 的品系都为C57/BL6小鼠。对这二种小鼠的心脏进行表型分析，通过石蜡切片鉴定整体外形，通过HE及WGA染色确定细胞的横截面积大小(图1A)，同时检测了心脏体重比(图1B)， 实验结果显示miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠相比心脏表型没有明显的增大，心脏体重比也没有显著的提高，说明miRNA-23a转基因小鼠本身并没有明显的肥大表型改变。同时检测的心功能的指标包括左心室后壁厚度(LVPWd)，短轴缩短率(F。(图 1B)，实验结果显示miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的心脏功能没有明显的区别。实验例2 miRNA-23a转基因小鼠在PE刺激下与野生型小鼠相比表型及心功能有了明显的改变对miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的心脏用肥大刺激因子即苯肾上腺素 (PE)腹腔埋泵注射二周后进行表型分析(按同样的操作条件将miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的心脏加盐处理，作为负对照)，通过石蜡切片鉴定整体外形，通过HE染色(图 2A)，同时检测了心脏体重比(图2A)。实验结果显示miRNA-23a转基因小鼠经过PE处理后的表型与野生型小鼠相比心脏表型有了明显的增大，心脏体重比也有了显著的提高，说明经过PE处理后的miRNA-23a转基因小鼠有了明显的肥大表型改变。如图2B所示，心功能的检测包括左心室后壁厚度(LVPWd)，短轴缩短率(FS)以及室间隔厚度(LVSd)与野生型小鼠相比有了明显的肥大改变(按同样的操作条件将 miRNA-23a转基因小鼠与野生型小鼠的心脏加盐处理，作为负对照)。实验例3在PE和ET-I刺激下miRNA_23a表汰水平的变化对于心肌细胞肥大模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞 (大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献W.-Q. Tan, etal, Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem. 20080ctober 31 ；283 (44) :29730—29739)，)(寸心肌细胞用PE和ET-I进行处理，在培养的不同时间，提取细胞的总RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-23a的表达水平。如图3A、!3B所示，miRNA_23a表达水平在PE和ET-I处理6 小时之内有了显著的上升。实验例4 miRNA-23a反义核苷酸能够在细胞水平上抑制PE所诱导的肥大对原代心肌细胞转染miRNA-23a反义核苷酸(anta-23a)后，能有效的抑制了 miRNA-23a的表达，同时细胞用PE对心肌细胞进行处理，及同时用miRNA-23a反义核苷酸的负对照(anta-NC)处理，经过M小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，如细胞表面积(图4A)、蛋白/DNA(图4B)及肌小节的重组(图4C)检测(按同样的操作条件将小鼠的心脏加盐处理，作为负对照)。实验结果证明miRNA-23a反义核苷酸能够有效的抑制PE 所诱导的心肌细胞肥大。实验例5小鼠静脉注射miRNA_23a反义核苷酸(antagomir)能抑制PE所诱导的 fl巴大樽型对小鼠用PE埋泵处理二周后，小鼠的心脏有明显的肥大表型，而同时加入 miRNA-23a反义核苷酸(anta-23a)可以明显减弱PE所诱导的肥大效应(按同样的操作条件将小鼠的心脏加盐处理，作为负对照)。但是，同时向小鼠注射miRNA-23a反义核苷酸的负对照(anta-NC)和PE，如图5A所示，并不能减弱PE的肥大表型，同时也检测了细胞的横截面积大小(WGA染色)及心脏体重比(图5B、5C)。实验结果证实miRNA-23a反义核苷酸能够在整体水平抑制PE所诱导的心脏肥大的发生。实验例6小鼠静脉注射miRNA_23a反义核苷酸(antagomir)能抑制主动脉缩窄 (TAC)所诱导的小鼠心脏吧大樽型对小鼠用主动脉缩窄(Thoracic aorta constriction, TAC)的方法处理三周后能够诱导肥大表型的产生。而同时加入miRNA-23a反义核苷酸(anta-23a)可以明显减弱 TAC所诱导的肥大效应。但是，加入miRNA-23a反义核苷酸的负对照(anta-NC)的组别与 TAC组别比没有明显的改变即并不能减弱TAC所诱导的肥大表型(图6A)，同时也检测了心脏体重比(图6B)及细胞的横截面积大小(WGA(Wheat germ agglutinin)染色)(图6C)。 以上的实验结果证实miRNA-23a反义核苷酸能够在整体水平抑制TAC所诱导的心脏肥大的发生。
权利要求
1.miRNA-23a的反义核苷酸在制备用于诊断、预防或治疗心脏疾病药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-23a的核苷酸序列如下述SEQ ID NO 1的序列所示5 ‘ -GGAAAUCCCUGGCAA腳GAU-3‘。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病及心衰。
4.一种药物组合物，该药物由有效量的miRNA-23a反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料组成。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为胆固醇、纳米颗粒或脂质体。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述心脏疾病包括心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病及心衰。
全文摘要
本发明提供一种miRNA-23a反义核苷酸在用于制备治疗心脏病药物中的用途，所述miRNA-23a的核苷酸序列如下述SEQ ID NO1的序列所示5′-GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU-3′；miRNA-23a的反义核苷酸通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可成为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。
文档编号A61P9/04GK102251037SQ20111019073
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者李培峰, 王昆 申请人:中国科学院动物研究所