专利名称：抑制白血病细胞端粒酶活性的反义核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及反义核酸及其应用，尤其是人类端粒酶RNA的反义核酸及其在制备治疗白血病药物中的应用。
背景技术：
端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白逆转录酶，由小分子RNA和蛋白质组成。端粒酶内RNA具有模板功能，它以酶内部RNA组分序列为模板，合成富含G的端粒DNA链，将端粒重复序列添加到端粒3’末端上，通过延长端粒而维持肿瘤细胞的持续增殖能力。端粒酶在维持肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要的作用，迄今发现大部分正常人体细胞不表达端粒酶活性，只有极少数正常自我更新组织如造血细胞、生殖细胞表达低水平的端粒酶活性，而恶性肿瘤组织端粒酶阳性率远远高于正常组织及肿瘤周围临近组织，人体绝大多数肿瘤近90％有端粒酶的活化表达。大量研究表明端粒酶对肿瘤的诊断、疗效和预后的判断可提供有用的信息，端粒酶被认为是一种广泛的肿瘤标志。
现已明确人端粒酶由三个亚单位组成人类端粒酶RNA(humantelomerase RNA transcript，hTR)、端粒酶相关蛋白(telomerase associatedprotein I，TPI)和端粒酶催化活性亚单位(telomerase catalytic subunit，亦称human telomerase reverse transcriptase，hTERT)。在端粒酶亚单位中，TPImRNA广泛存在于各种人体组织中而不被认为具有逆转录酶催化活性，hTERT是端粒酶活性的主要调控亚单位，与端粒酶活性具有直接的相关性，hTR则主要起到一个模板的作用，hTR模板区含有11个核苷酸(5’-CUAACCCUAAC-3’)，合成端粒亚单位(5’-TTAGGG-3’)。
造血系统的恶性肿瘤普遍表现出端粒酶活性，而且活性水平在每种肿瘤中各不相同，急性白血病(AL)端粒酶活性最强，慢性粒细胞白血病(CML)部分端粒酶活性部分表达，而在急变期则表达增加，慢性淋巴细胞白血病及外套型淋巴瘤、毛细胞白血病的端粒酶活性亦明显高于正常B细胞，在多发性骨髓瘤及浆细胞白血病中亦可检出较高的端粒酶活性，且端粒酶活性程度与hTER及hTR的表达水平呈正相关。
以端粒酶为靶点的肿瘤治疗成为肿瘤基因治疗的新途径。国内外已经有报道，以hTERT基因为反义核酸的作用靶点来抑制肿瘤细胞端粒酶活性并可增加肿瘤细胞对化疗的敏感性(李文瑜，张洹主篇。hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性影响[J].中国病理生理杂志，2002，18(1)。但以hTR为靶点的反义核酸对肿瘤细胞端粒酶活性及诱导肿瘤细胞对化疗药物敏感性的研究则较少报道，特别是对白血病细胞端粒酶活性及诱导白血病细胞对化疗药物敏感性的研究则国内外尚未见报道。
目前，药物对于恶性肿瘤的联合治疗仍然主要依耐两种或多种细胞毒药物的联合应用，化疗的毒性及早期出现耐药性仍然成为治疗成功的障碍，而且绝大多数传统的化疗药物主要作用于肿瘤细胞的DNA而抑制肿瘤的生长。核酸化学和生物领域的发展及对肿瘤发生的认识进一步加深，使设计出以寡核苷酸为基础的治疗药物成为现实，利用反义寡核苷酸联合化疗治疗肿瘤，不仅可提高疗效，同时还可以降低两者单独使用的副作用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种以hTR为靶点的抑制白血病细胞端粒酶活性的反义核酸。
本发明的另一个目的是提供上述反义核酸在制备治疗白血病药物中的应用，以减小化疗的毒性及避免早期耐药性。
本发明以端粒酶RNA(hTR)模板区起始序列为靶点的反义核酸的序列为5’-TACGCCCTTCTCAGTTAGGG-3’。序列进行全硫代修饰。
上述的反义核酸用于制备治疗白血病的药物，可大大降低白血病细胞端粒酶的活性。与顺铂(CDDP)联用制备治疗白血病的药物，在端粒酶活性降低后，增加了对顺铂的敏感性，增强了顺铂的促凋亡作用。
发明人选用了K562和HL-60细胞系作为异常造血模型，应用细胞生物学、实验血液学、药理学及分子生物学方法，进行了一系列实验，系统地研究了hTR反义核酸对K562、HL-60细胞端粒酶活性的影响，观察了端粒酶活性的改变对化疗药物诱导K562、HL-60细胞凋亡的影响。
实验方法1、反义核酸、正义核酸的合成合成hTR反义核酸的序列为5’-TACGCCCTTCTCAGTTAGGG-3’；另外合成一段hTR的正义核苷酸序列作为对照，随机无关序列为5’-GTATAGTGGGTTGCTGGATG-3’；每一条链均对其进行全硫代修饰，合成后纯化、分装，-20℃保存备用。临用前配制。
2、细胞培养采用含体积分数为10％小牛血清(60℃灭活30分钟)、100U/ml青霉素、100μg/ml的RPMI 1640培养基，在37℃、5％CO2饱和湿度下培养，每2-3天换液传代1次，收获对数生长期细胞进行实验。
3、细胞生长曲线和倍增时间的测定将K562及HL-60细胞以1×105个/ml细胞的浓度接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养体中，常规培养条件下培养，用0.4％台盼蓝记数，连续7天，将得到细胞数用计算机运算，并按下列公式计算细胞生长抑制率细胞生长抑制率＝(对照组细胞数-处理组细胞数)/对照组细胞数×100％。得出细胞的生长曲线及倍增时间参数。
4、hTR反义核酸最适作用浓度的选择和细胞增殖的检测在24孔培养板上分为3组进行实验空白对照组(不加寡核苷酸)、反义核酸作用组、正义核酸作用组。每组做3个平行孔，每孔接种1×105个/ml细胞。寡核苷酸的浓度分为4组5、10、15、20μmol/L，并作为初始浓度，第2、3天加入初始浓度的一半，空白对照组加入相同体积的培养液。观察时间分别为24、48、72小时。采用台盼蓝拒染法计数细胞数，得到对细胞无毒性作用的最大浓度作为对进一步实验所采用浓度。同时收集细胞进行端粒酶活性测定。
5、端粒酶活性测定5.1、端粒酶蛋白的提取(1)收集K562和HL-60细胞及寡核苷酸处理不同时间后的K562和HL-60细胞，以冰冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，离心去上清；(2)加入200μl端粒酶预冷裂解液悬浮细胞，冰浴30分钟；(3)4℃，16000转离心20分钟；(4)取上清10μl加双蒸水50μl。
5.2、上清液中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，以BAS作为标准，用紫外分光光度计进行测定。
5.3、端粒重复序列扩增法(TRAP)反应(1)引物延伸将上述上清液2μl(5μg)、25μl反应混合液、23μl无菌焦碳酸二乙脂(DEPC)水加入PCR扩增管，置25℃，10min；(2)端粒酶的灭活94℃，5分钟；(3)聚合酶链式反应(PCR)扩增50μl反应体系，包括脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、Taq酶、生物素标记I和引物II，置94℃30秒，72℃90秒，30次循环；(4)平衡置72℃10分钟。
5.4扩增产物的检测(ELISA法)(1)取5μl PCR扩增产物，加入20μl变性试剂，置室温(20℃)孵育10分钟；(2)加入255μl杂交混合液(含地高辛标记的控针)，充分混匀；(3)转100μl混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上，37℃摇床杂交2小时；(4)加入偶联过氧化物酶的抗地高辛抗体(anti-DIGPOD)100μl，温室下孵育30分钟；(5)250μl洗涤缓冲液洗3次。加入偶联过氧化物酶的抗地高辛抗体100μl，室温下孵育30分钟；(6)最后加入100μlPOD的底物TMB显色10分钟，最后加100μl终止液；(7)取20μl再加入80μl双蒸水，以655nm作为参比波长，测定样品在450nm波长的吸光度(A)值。根据A＝A450-A690计算。
6、台盼蓝拒染法检测hTR反义核酸与化疗药物联合对K562、HL-60细胞生长的抑制作用实验分为6组，细胞对照组；细胞+hTR反义核酸组；细胞+hTR正义核酸组；细胞+化疗药物组；细胞+化疗药物+hTR反义核酸组；细胞+化疗药物+hTR正义核酸组。上述各组细胞接种于24孔培养板，细胞接种密度均为1×105/ml(以下同)。第一天加入寡核苷酸10μmol/L，24、48小时再分别追加半量；化疗药物在24小时加入；分别在24、48、72小时采用台盼蓝拒染法计数细胞数。每组实验重复3次。
7、姬姆萨(Giemsa)染色观察细胞形态(1)细胞悬液离心去除上清后，将细胞重悬于PBS中，使细胞浓度为1×106个/ml；(2)取100μl细胞悬液均匀涂布于载玻片上，晾干；(3)以甲醇固定10分钟；(4)用Giemsa染液与Sorensen磷酸缓冲液以1∶9混合成工作液(现用现配)，染色6～8分钟(室温)，冲洗多余染液，空气干燥(室温晾干24小时)；(5)用二甲苯浸泡3分钟，去除杂质，使载玻片透明后，以树脂封片；(6)普通光学显微镜下观察细胞形态并照相。
8、AnnexinV和PI双染色法(1)细胞悬液离心去除上清后，以0.1mmol/LPBS(PH7.4)洗2次；(2)190μl结合缓冲液悬浮细胞，细胞浓度为1×106个/ml；(3)转100μl细胞悬液入5ml培养管，加Annexin V-FITC 5μl及PI染液10μl，混匀，置37℃培养30分钟；(4)离心去染液，滴片，用olympus荧光显微镜观察并照相。
9、凋亡细胞DNA抽提和电泳(1)收集细胞，1000×g离心5分钟后彻底弃上清；(2)细胞用0.01mol/l pH7.4的PBS洗2次，1000×g，离心5分钟；(3)胞沉淀加含0.05％SDS、0.25mg/ml蛋白酶K、50mmol/L Tris-HCL(pH8.0)和10mmol/LEDTA裂解液0.5ml重悬细胞，50℃水浴反应1小时，震荡；(4)0.5ml酚和0.5ml氯仿/异成醇抽提(震荡30秒，离心5分钟)；(5)取上清加入1/10体积的3mol醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，混合；(6)-20℃过夜后，12000×g，离心沉淀DNA；70％乙醇洗1次，晾干；(7)加入200μl TE缓冲液及0.125mg/ml Rnase A，37℃水浴1小时；(8)1.5％琼脂糖，2V/cm凝胶电泳3-4小时；凝胶图象分析仪观察并摄片。
10、流式细胞仪检测细胞凋亡将培养72小时的细胞收集后，用PBS洗涤2次，然后以70％冰乙醇-20℃固定24小时。再经PBS洗涤1次，RNA酶A(终浓度500μg/ml)37℃30分钟，碘化丙啶(PI，终浓度50μg/ml)4℃，30分钟，尽快(1小时内)流式细胞仪检测。
11、数据均采用均数±标准(x±s)表示，用SPSS8.0 for windows统计软件包进行统计学分析处理，多样本均数比较采用ANOVA方差分析(Student-Newman-Keuls法)；率的比较采用卡方检验，以P＜0.01或＜0.05差异有显著意义。
下面结合附图对本发明的实验结果作进一步具体分析。
图1是K562和HL-60细胞的生长曲线图。
图2a和图2b显示了hTR反义核酸对K562和HL-60细胞生长的影响。
图3a和图3b显示了hTR反义核酸对K562和HL-60细胞端粒酶活性的影响。
图4a和图4b显示了hTR反义核酸与化疗药物柔红霉素联合应用对K562及HL-60细胞系生长的影响。
图5a和图5b显示了hTR反义核酸与阿糖胞苷联合应用对K562及HL-60细胞系生长的影响。
图6a和图6b显示了hTR反义核酸与化疗药物足叶乙甙联合应用对K562及HL-60细胞系生长的影响。
图7a和图7b显示了hTR反义核酸与化疗药物顺铂(CDDP)联合应用对K562及HL-60细胞系生长的影响。
图8a、图8b是用Giemsa染色法(×1000)观察的未经顺铂处理和经顺铂处理的K562细胞凋亡形态图。
图8c、图8d是用Giemsa染色法(×1000)观察的未经顺铂处理和经顺铂处理的HL-60细胞凋亡形态图。
图9a、图9b是用AnnexinV和PI双染色法(×1000)观察的未经顺铂处理和经顺铂处理的K562细胞凋亡形态图。
图10是hTR反义核酸与顺铂5μmol/L联合应用72小时诱导K562细胞凋亡的DNA电泳图。
图11a和图11b显示了hTR反义核酸与顺铂联合应用诱导K562、HL-60细胞凋亡的百分率。
各图中ASPS-ODN反义硫代寡脱氧核糖核酸；SPS-ODN正义硫代寡脱氧核糖核酸；DNR柔红霉素；Ara-C阿糖胞苷；VP16足叶乙甙；CDDP顺铂；bp碱基对。
见图1K562和HL-60细胞分别以1×105/ml的浓度接种于10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，1-7天采用台盼蓝拒染法计数细胞数，结果为三次实验的均值。如图1所示，两种细胞均在1-5天呈指数生长，K562细胞倍增时间为19小时，HL-60细胞倍增时间为21小时。
见图2a、图2bhTR反义核酸、正义核酸浓度为10μmol/L，24小时后追加半量，图中数值为三次重复实验的均值表示。可见，5-10μmol/L的hTR反义核酸、正义核酸作用组在24、48、72小时，对K562和HL-60细胞的生长无明显抑制。
见图3a、图3bN阴性对照；P阳性对照，U937细胞；A细胞组，未加入正义核酸或反义核酸；B细胞+正义核酸组；C细胞+反义核酸组。经PCR-ELISA法检测，以各组细胞的吸光度A值表示端粒酶活性高低，A、B、C三组数据包括各组细胞在24、48、72小时的端粒酶活性。可见，hTR反义核酸作用于K562和HL-60细胞其端粒酶活性无影响，48小时端粒酶活性逐渐下降，72小时最显著。而hTR正义核酸对两者端粒酶在24、48、72小时无影响。
见图4a、图4b、图5a、图5b、图6a、图6bhTR反义核酸作用于K562、HL-60细胞，24小时再加入柔红霉素、阿糖胞苷或足叶乙甙，对细胞生长的抑制分别与hTR正义核酸联合柔红霉素、阿糖胞苷或足叶乙甙，及单用柔红霉素、阿糖胞苷或足叶乙甙相比较，统计学上无显著差异。
见图7a、图7bcell只加入相应的细胞，未加入反义核酸、正义核酸；S PS-ODN细胞+正义核酸组；AS PS-ODN细胞+反义核酸组；CDDP2.5μM细胞+CDDP2.5μM；CDDP2.5μM+S PS-ODN细胞+CDDP2.5μM+正义核酸；CDDP2.5μM+AS PS-ODN细胞+CDDP2.5μM+反义核酸；CDDP5μM细胞+CDDP5μM；CDDP5μM+S PS-ODN细胞+CDDP5μM+正义核酸；
CDDP5μM+AS PS-DON细胞+CDDP5μM+反义核酸。
从图7a、图7b可见hTR反义核酸与顺铂联合应明显增加顺铂对细胞生长抑制作用，分别同hTR正义核酸联合顺铂组、单用顺铂组进行比较有非常显著差异。而且hTR反义核酸联用5μmol/L顺铂组与联用2.5μmol/L顺铂组差异亦有显著性；而hTR正义核酸作用于K562、HL-60细胞24小时再加入2.5μmol/L或5μmol/L顺铂对K562、HL-60细胞的生长抑制作用与单独使用2.5μmol/L或5μmol/L顺铂相比，无显著性差异。
见图8a、图8b、图8c、图8dA未处理的K562、HL-60细胞；BhTR反义核酸与顺铂联合应用。
细胞形态学观察显示5μmol/L CDDP作用于K562、HL-60细胞48小时后，在普通光镜(姬姆萨染色，100×10)下可观察到少量凋亡细胞，而hTR反义核酸(10μmol/L)作用于K562、HL-60细胞24小时再加入CDDP观察48小时后K562、HL-60细胞凋亡数明显增多，并可见到部分细胞的细胞膜皱缩，细胞核染色质凝集，核固缩，碎裂，凋亡小体形成等典型凋亡形态学变化。
见图9a、图9bA未处理的K562细胞；BhTR反义核酸联合顺铂作用48h后的细胞。
荧光显微镜(AnnexinV和PI双染色，100×10)下可见凋亡细胞发生核固缩并断裂成大小不一的染色质DNA片段，呈颗粒状荧光，而未凋亡的细胞细胞核呈弥散均匀荧光。透射电镜下也可观察到细胞体积缩小，胞膜出芽，细胞核缩、碎裂等凋亡表现。而正义核酸组及对照组则无上述凋亡形态学变化(图中未显示)。
见图10M为100bp标准DNA条带；2为未经处理的K562细胞；3为单独应用5μmol/L顺铂作用72小时；4为正义核酸联合顺铂作用72小时；5为反义核酸联合顺铂作用72小时。
可见10μmol/L hTR反义核酸作用于K562、HL-60细胞24小时再加入顺铂5μmol/L，作用72小时，琼脂糖凝胶电泳即可见相隔180-200bp的梯状DNA条带。细胞对照组、单用顺铂组、正义核酸与顺铂联合作用组在72小时均未见明显的梯状DNA条带，而仅表现为相对分子量很大的一条带。
见图11a、图11b图中所示为K562、HL-60细胞加入hTR反义核酸或正义核酸24小时，再加入顺铂5μmol/L，48小时经流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。HTR反义核酸与顺铂5μmol/L联合应用组，与单用顺铂5μmol/L组、hTR正义核酸+顺铂5μmol/L相比，具有显著差异性。
实验结果表明1、以端粒酶RNA(hTR)模板区起始序列为靶点的上述反义核酸能特异性的抑制K562、HL-60细胞端粒酶活性。
2、hTR反义核酸与端粒酶活性密切相关，其抑制K562、HL-60细胞端粒酶活性与浓度及作用时间正相关。
3、K562、HL-60细胞在端粒酶活性降低后，增加了对顺铂的敏感性，增强了顺铂的促凋亡作用。而柔红霉素、阿糖胞苷、足叶乙甙则无诱导凋亡作用，即hTR反义核酸诱导化疗药物促凋亡作用有一定选择性。
4、hTR反义核酸的上述作用为白血病细胞端粒酶活性与耐药关系提供实验依据，也为hTR反义核酸提高白血病对化疗药物敏感性、减低化疗毒性提供了充分的实验依据，为hTR反义核酸在制备临床治疗白血病药物中的应用提供了充分的实验依据。
具体实施例方式合成序列为5’-TACGCCCTTCTCAGTTAGGG-3’的反义核酸，全硫代修饰。上述反义核酸与顺铂联合用于制备治疗白血病的药物，反义核酸的终浓度为5-10μmol/L，顺铂的终浓度为2.5-5μmol/L。
序列表(144-163)一、人类端粒酶RNA(hTR)序列1U86046.Human telomerase...[gi2660645]LOCUS HSU86046 545 bp DNA Iinear PRI08-FEB-2002DEFINITION Human telomerase RNA(hTR)gene sequence.
ACCESSION U86046 S79400VERSIONU86046.1 GI2660645TITLE The RNA component of human telomeraseJOURNALScience 269(5228)，1236-1241(1995)ORIGIN1 gagtgactct cacgagagcc gcgagagtca gcttggccaa tccgtgcggt cggcggccgc61 tccctttata agccgactcg cccggcagcg caccgggttg cggagggtgg gcctgggagg121 ggtggtggcc attttttgtc taaccctaac tgagaagggc gtaggcgccg tgcttttgct181 ccccgcgcgc tgtttttctc gctgactttc agcgggcgga aaagcctcgg cctgccgcct
241 tccaccgttc attctagagc aaacaaaaaa tgtcagctgc tggcccgttc gcccctcccg301 gggacctgcg gcgggtcgcc tgcccagccc ccgaaccccg cctggaggcc gcggtcggcc361 cggggcttct ccggaggcac ccactgccac cgcgaagagt tgggctctgt cagccgcggg421 tetctcgggg gcgagggcga ggttcaggcc tttcaggccg caggaagagg aacggagcga481 gtccccgcgc gcggcgcgat tccctgagct gtgggacgtg cacccaggac tcggctcaca541 catgc二、本发明hTR反义寡核苷酸序列5’-TACGCCCGGCGCAGTTAGGG-3’三、作对照的hTR核苷酸序列5’-GTATAGTGGGTTGCTGGATG-3’
权利要求
1.一种抑制白血病细胞端粒酶活性的反义核酸，其序列为5’-TACGCCCTTCTCAGTTAGGG-3’。
2.根据权利要求1所述的反义核酸，其特征在于所述序列进行全硫代修饰。
3.权利要求1或2所述的反义核酸在制备治疗白血病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述反义核酸与顺铂联合用药。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述反义核酸的终浓度5～10μmol/L，顺铂的终浓度为2.5～5μmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种抑制白血病细胞端粒酶活性的反义核酸，序列为5’－TACGCCCTTCTCAGTTAGGG－3’。该反义核酸用于制备治疗白血病的药物，可大大降低白血病细胞端粒酶的活性。与顺铂联用制备治疗白血病的药物，在端粒酶活性降低后，增加了对顺铂的敏感性，增强了顺铂的促凋亡作用。
文档编号A61P35/00GK1513867SQ03139789
公开日2004年7月21日 申请日期2003年7月11日 优先权日2003年7月11日
发明者张洹, 肖扬, 张 洹 申请人:暨南大学