miR-21反义核苷酸修饰的骨髓间充质干细胞的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及成体干细胞领域，通过特异性反义核苷酸序列沉默间充质干细胞 (mesenchymalstemcell，MSCs)中内源性miR-21的表达水平增强了MSCs的免疫调节能 力，并研究修饰后的MSCs用途。
【背景技术】
[0002] 传统概念中骨髓间充质干细胞等MSCs首次分离后被证明在不同的诱导环境下可 以分化为骨、软骨、脂肪、胰岛、肝脏和神经等不同组织细胞，是目前治疗骨骼疾病最常用的 种子细胞，但随着体外培养时间的延长，其移植回体内后成骨能力明显下降，而且其多向分 化能力也逐渐丢失。此外研究表明骨髓间充质干细胞能够通过抑制多种免疫细胞如树突状 细胞，T淋巴细胞，B淋巴细胞的功能，发挥重要的免疫调节作用。临床上MSCs被运用到全 身，治疗各种系统性疾病，如糖尿病，类风湿性关节炎，干燥综合征等，在机体免疫调控中发 挥着重要作用。但是尚需要开发输注细胞的新途径，目前通过静脉输注细胞的方法。其所 面临的问题就是植入效率不均一，对有些病例不能产生明显和持久的治疗作用。此外，随着 体外培养的时间延长，MSCs也会丧失部分的生物学活性，降低应用效率。越来越多的课题 组都开始意识到重新寻找构建一种提高MSCs的植入效率的重要性，使其产生更加明显和 持久的治疗作用。
[0003] 微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类参与基因转录后水平调控的小分子、非编 码的单链RNA，长度19~25nt，与细胞的生长转归有密切关系，能调控细胞增殖、分化等。 miRNAs介导特异性的基因沉默或激活靶mRNA而影响蛋白质合成，调控转录后水平的基因 表达，现已证明miRNAs能够调控多种生理学和病理学过程[8-10]。miRNAs具有高度的生物 进化保守性、组织特异性、基因簇集现象、时空特异性等生物学特性[11]。miRNAs通过RNA 干扰途径降解靶mRNA;动物中miRNAs与靶mRNA的3'-不翻译区部分序列反向互补结合， 与RNA干扰不同的是，革ElmRNA的稳定性不受影响，而翻译起始后受抑制。因此，通过miRNAs 的特异性互补反义链可以改变细胞中miRNA的表达水平，增加靶基因的转录后水平从而改 变细胞的增殖，分化能力。
[0004]目前可通过在细胞中使用脂质体转染的方式特异沉默细胞内内源性miRNA的表 达水平。此种改变miRNA表达的基因修饰方式与传统的基因修饰相比有：不需要病毒载体， 解决了病毒在体内的不可控性的问题；转染效率高；易操作等特点。通过在细胞中使用脂 质体转染miRNA的特异反义链可高效地沉默细胞内miRNA的内源性表达。在本课题组的研 究中发现，miR-21的表达水平负向调控MSCs中转换生长因子-0I(transforminggrowth factor-0 1，TGF-0 1)的表达水平。TGF-0 1作为一种免疫抑制剂可以抑制免疫活性细 胞的增殖和抑制淋巴细胞增殖，从而影响MSCs的免疫调节能力。因此本
【发明内容】
为利用 miR-21反义链转染MSCs增强细胞分泌TGF-1的能力，进而持续增强MSCs的免疫调节能 力。之后再将miRNA反义链修饰过的MSCs应用到干细胞治疗效果不明显或者无效的系统 性疾病中，提高干细胞在有效时间内对于系统性疾病的治疗效果。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 1)提出一种简便、成本低廉、不需要病毒载体且对人体无毒副作用的干细胞修饰 方法；
[0007] 2)提出经上述修饰后的干细胞的制备方法；
[0008] 3)提出经上述修饰增强干细胞免疫调节能力特性的优化方法；
[0009] 4)提出经修饰后的干细胞可能治疗的临床疾病。
[0010] 发明思路
[0011]anti-sense-miRNA作为相应miRNA的完全互补链，均是经2' 甲基稳定性化 学修饰的小RNA分子。可以通过与对应miRNA特异性相互作用，促进该miRNA的降解，从而 实现对特定miRNA功能的抑制，阻断miRNA在细胞中的作用。通过前期研究发现miR-21能 够负向调节MSCs的免疫调节能力。因此本专利内容欲通过脂质体转染的方式将miR-21的 反义链miR-21inhibitor转染进入细胞，特异性沉默细胞中miR-21的表达水平，阻断细胞 内miR-21下游通路来提高MSCs的免疫调节能力。因此如何将这种核苷酸序列导入细胞的 方式将是一个重要的考虑内容。另外导入miR-21inhibitor的浓度也是需要谨慎选择的， 最佳的浓度下才可以起到最佳的效果，最后找到修饰后干细胞的制备方法及应用的适应症 都是本发明专利的内容。
[0012] 本发明的有益效果
[0013] 1.本发明所制备的干细胞方法简便、快捷、产品无害。
[0014] 镜下观察发现，本发明制备的MSCs维持了基本的细胞形态，保持了细胞间连接， 并且保存了细胞外基质连接形成的支架，未破坏细胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能转 染miR-21inhibitor对干细胞的增殖和凋亡没有影响，说明转染miR-21inhibitor对MSCs 没有细胞毒性。
[0015] 2.本发明所制备的干细胞产品生物学性能稳定，通过在体外对其性能的优化并筛 选，明确所制备的产品具有更显著的免疫能力
[0016] 从基因水平检测发现，在转染后一周时间内人MSCs、小鼠BMMSCs均可稳定地维持 沉默miR-21的表达效应，而且可持续大幅度提高细胞对TGF-P1的分泌水平；同时通过与 T细胞共培养可促进T细胞向调节性T细胞（regulatoryTcells，Tregcells)分化比例。 即本发明所制备的干细胞产品增强了干细胞的免疫调节能力。
[0017] 3.本发明所涉及的干细胞产品与不修饰的细胞相比在小鼠体内炎性环境下，对自 身免疫病及免疫紊乱等系统性免疫疾病具有更加持久和明显的效果。
[0018] 在小鼠体内用药物诱导肠炎后，通过尾静脉输入miR-21inhibitor修饰后的 BMMSCs，发现输入转染miR-21inhibitorBMMSCs组的治疗效果明显优于转染对照组及不 转染组，且改善血清免疫学相关指标，恢复体内免疫。即本发明所制备的干细胞产品在体内 具有更明显的治疗效果。
[0019] 具体实验数据和说明见实施例部分。
【附图说明】
[0020] 1.图1为实施例I:实验中所使用干细胞生物学特性鉴定；
[0021] 2.图2为实施例2 :在细胞中miR-21转染试剂及转染浓度筛选；
[0022] 3.图3为实施例3 :miR-21沉默最佳转染浓度筛选制备miR-21inhibitor-MSCs的 方法；
[0023] 4.图4为实施例4:转染miR-21inhibitor不影响小鼠BMMSCs的增殖和凋亡；
[0024] 5.图5为实施例5 :miR-21负向调控中细胞内TGF-f3 1的表达水平；
[0025] 6?图6为实施例6 :miR-21负向调控BMMSCs的免疫调节能力；
[0026] 7.图7为实施例7 :TGF-P1抗体可中和miR-21调控BMMSCs免疫调节能力效应；
[0027] 8.图8为实施例8 :miR-21沉默BMMSCs能够更加有效治疗DSS诱导的小鼠实验 性肠炎；
[0028] 9.图9为实施例9 :miR-21沉默BMMSCs上调肠炎小鼠血清TGF-P1及下调IL-17 水平。
【具体实施方式】
[0029] 细胞培养
[0030] 实验材料健康人骨髓来自于外伤或正颂外科需要腓骨移植患者，健康人牙周组 织来自于因正畸需要无感染的前磨牙或第三磨牙，健康人乳牙牙髓组织来自于临床因滞留 而需要拔除的乳牙。
[0031] 1.人牙源性MSCs的培养
[0032] 人牙髓干细胞培养
[0033] 新鲜拔除的牙齿立即放入装有无菌PBS和抗生素的离心管，在12小时内分离培养 牙髓干细胞。用无菌纱布包裹牙齿硬组织，并用酒精浸泡消毒过的锤子敲打并敲开牙体获 得牙髓组织，用PBS反复清洗，尽量剪碎，置含3mg/mlI型胶原酶和4mg/mlDispase溶液 中，37°C水浴消化0. 5-1小时，过70ym细胞筛收集细胞，1000 rpm离心lOmin，用