肾脏足细胞的制备方法及其专用培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及由间充质干细胞诱导分化细胞的方法，特别涉及肾脏足细胞的制备方 法及其专用培养基。
【背景技术】
[0002] 肾脏是人体最重要的器官之一，其主要生理功能是通过生成尿液以清除体内代谢 产物、以及进入机体过剩物质和毒物等，同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质实现 对体液、电解质和酸碱平衡的调节，维持机体内环境的稳定。
[0003] 肾脏足细胞，即肾小囊脏层上皮细胞，是维持肾小球滤过屏障正常结构和功能的 重要成分，在维持肾小球通透性，对抗毛细血管腔内流体静水压方面发挥重要作用。高血 压、糖尿病、肾毒性药物、原发性肾小球肾炎、肿瘤等多种因素可导致肾脏足细胞的损伤。由 于足细胞是高度分化的终末细胞，一旦缺失几乎不可再生，足细胞进行性的损伤丢失，导 致肾小球滤过膜的完整性遭到破坏，形成蛋白尿，而蛋白尿的出现又进一步加重足细胞损 伤，由此构成的恶性循环最终导致肾小球硬化的发生，影响肾脏功能，引发慢性肾脏疾病 (chronickidneydisease,CKD)。临床上针对这些发病机制采取各种可能的治疗方法，包 括控制血压、血糖、血脂，药物干预抑制炎症、调节免疫、严格控制蛋白摄入、减少蛋白尿等， 尽可能的延缓肾脏疾病的进展。但是由于治疗反应性不一，部分病人病情持续进展，肾功能 的进行性下降，最终导致终末期肾病（endstagerenaldisease,ESRD)。
[0004]据美国肾病数据登记系统（theUnitedStatesRenalDataSystem，USRDS)显 示，CKD在成人中的发生率大约为13. 6%，且近年来CKD的发病率在不断增加，截止2012 年，美国国内ESRD患者达636 905例，新增患者114 813例，其中88 638人死于ESRD。血 液透析、腹膜透析和肾脏移植仍是目前CKD及ESKD最主要和最有效的治疗手段，然而透析 只能部分代替肾脏的滤过功能，肾脏移植仍是目前ESRD患者恢复健康最为理想的治疗方 法。但是移植器官资源严重匮乏，远远不能满足病人的需求，绝大部分ESRD患者由于未能 及时接受肾脏移植而死于慢性肾脏疾病及其相关并发症，慢性肾脏疾病已成严重威胁人类 健康的疾病之一。
[0005] 干细胞（stemcell)是一类高度增殖，具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在 一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞。依据干细胞来源可将其分为：胚胎干细胞 (embryonicstemcells，ESCs)、成体干细胞和诱导多能干细胞（inducedpluripotent stemcells，iPSs)。间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是一类具有免疫调 节功能和高度可塑性的成体干细胞，其来源广泛，取材方便，且具有低免疫原性，不受伦理 限制及没有成瘤危险的特点，因此以MSCs为种子细胞，通过体外诱导定向分化为肾脏足细 胞，修复肾小球滤过屏障，改善肾脏功能的作用，具有较高的临床应用价值。
[0006] 在适当的体外培养条件下，间充质干细胞可诱导分化为神经细胞、心肌细胞、胰岛 分泌细胞、肝细胞等多种成熟细胞，用以修复替换功能损伤的组织和器官，有效的改善相应 损伤组织的功能。近年来研究结果也表明，多种来源的干细胞具有向肾脏组织细胞分化的 潜能，可以替代受损的肾脏细胞。成熟肾脏中包含至少26种细胞，现有诱导体系，在体外诱 导干细胞向肾脏细胞分化的效率以及分化细胞的种类都非常有限，大部分研究报道均集中 在肾小管细胞的诱导分化，对于肾脏足细胞的分化研究还处于初步探索中，而针对间充质 干细胞体外向肾脏足细胞诱导培养体系的尚无报道。仅有相关文献利用诱导多能干细胞 (ips)诱导获得肾脏足细胞，由于iPSCs是由多种成体细胞重编程诱导获得，来源广泛，避 免了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥的问题。但是由于目前iPSCs转化效率低， 重编程机制的不明确以及在重编程过程中可能引发致癌基因的活化，也限制了iPSCs细胞 在临床治疗中的进一步应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种肾脏足细胞的制备方法及其专用培养基。
[0008] -方面，本发明提供将间充质干细胞诱导为肾脏足细胞的方法，其包括：1)将间 充质干细胞接种于培养基1中；以及2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于培养基2 中以得到肾脏足细胞，其中所述培养基1由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述溶质 包括：1. 9% -2. 1% 的胎牛血清、9. 75ng/mL-10. 25ng/mLactivinA以及 0? 95X10 5mol/ L-L05X10 5m〇l/L维甲酸；其中所述培养基2由动物细胞基础培养基和溶质组成，所述 溶质包括：1. 9% -2. 1% 的胎牛血清、9. 75ng/mL-10. 25ng/mLactivinA、0. 95X10 7mol/ L-L05X10 7mol/L维甲酸以及 19ng/ml-21ng/mlBMP7。
[0009] 优选地，本发明的方法包括如下步骤：
[0010] 1)将间充质干细胞接种于所述培养基1中，培养2-4天；以及
[0011] 2)将完成步骤1)的间充质干细胞转接于所述培养基2中，培养5-7天得到肾脏足 细胞。
[0012] 优选地，在所述步骤1)中培养3天，以及在所述步骤2)中培养6天。
[0013] 优选地，本发明的方法中所述动物细胞基础培养基是DMEM/F12培养基，在培养基 1中溶质包括2%的胎牛血清、lOng/mL的activinA和10 5mol/L的维甲酸；以及在培养基 2中包括2%的胎牛血清、10ng/mL的activinA、10 7mol/L的维甲酸和20ng/ml的BMP7。
[0014] 优选地，在本发明的所述步骤1)中，所述间充质干细胞在所述培养基1中的初始 浓度可为3XIO5个/ml-6X10 5个/ml，优选为5X10 5个/ml;优选地，培养过程的培养条件 可为：在37°C、5%C02、空气相对湿度为95%的培养箱中培养。
[0015] 优选地，其中所述步骤1)为在6孔板中加入培养基1，每孔2ml，然后接种第3代 间充质干细胞，使其在培养基中的浓度为5XIO5个/ml，在37 °C、5 %C02、空气相对湿度为 95%的培养箱中培养3天，每1. 5天吸弃上清并加入2ml新的培养基1 ;以及所述步骤2)为 吸弃步骤1的6孔板中的上清，加入培养基2,每孔2ml，在37°C、5%C02、空气相对湿度为 95%的培养箱中培养6天，每2天吸弃上清并加入2ml新的培养基。
[0016] 优选地，本发明的方法特征在于所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞；优选地， 所述脂肪间充质干细胞为人间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为第三代间充质干 细胞；优选地，所述间充质干细胞为人脂肪第三代间充质干细胞；优选地，所述间充质干细 胞为细胞因子⑶29、⑶44、⑶105和Flk-I均为阳性，细胞因子⑶31、⑶34、⑶106和HLA-DR 均为阴性的细胞。
[0017] 在另一方面，本发明还提供一种试剂盒，其包含培养基1和培养基2,所述培养基 1和2由动物细胞基础培养基和溶质组成；在培养基1中溶质包括：1. 9% -2. 1 %的胎牛血 清、9. 75ng/mL_10. 25ng/mLactivinA以及 0? 95X10 5mol/L_l. 05X10 5mol/L维甲酸；以 及在培养基2中溶质包括：1. 9% -2. 1%的胎牛血清、9. 75ng/mL-10. 25ng/mLactivinA、 0? 95X10 7mol/L-l. 05X10 7mol/L维甲酸以及 19ng/ml-21ng/mlBMP7。
[0018] 在本发明的试剂盒中，其中所述动物细胞基础培养基是DMEM/F12培养基，在培养 基1中包括2%的胎牛血清、lOng/mL的activinA和10 5mol/L的维甲酸；以及在培养基2 中包括2%的胎牛血清、lOng/mL的activinA、10 7mol/L的维甲酸和20ng/ml的BMP7。
[0019] 在另一方面，本发明提供利用本发明的方法所获得的肾脏足细胞，优选地所述肾 脏足细胞的N印hrin、Podocin和WTl表达量高于所来源的间充质干细胞。
[0020] 在又一方面，本发明还提供利用本发明的方法所获得的肾脏足细胞在制备用于治 疗肾脏足细胞相关疾病、以及在细胞移植治疗的药物中的用途，优选地所述肾脏足细胞相 关疾病为微小病变性肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病、糖尿病肾病。
[0021] 其中，本发明所述的人活化素A(activ