本发明涉及医学领域，具体而言，涉及一种破骨细胞培养基、其制备方法和培养破骨细胞方法。
背景技术：
人体的骨组织中含有成骨细胞和破骨细胞，共同负责完成骨吸收和骨形成两个骨重塑过程，两者处于动态平衡。破骨细胞是主要的骨吸收细胞，来源于骨髓造血干细胞，由骨髓中的多个单核巨噬细胞融合而成。破骨细胞数量和活性的增加与多种骨质流失的临床疾病密切相关，包括骨质疏松、慢性肾脏病并发的矿物质和骨代谢紊乱；破骨细胞还主导骨移植物的骨吸收作用和炎症性骨丢失等。这些疾病及其引发的骨折将严重影响患者的生活质量和生存时间。因此，为了在矿物质和骨代谢紊乱的发病机制与治疗方面寻求突破，破骨细胞成为相关研究的重点。随着时间的推移和科技的进步，破骨细胞的培养方法也日新月异。
破骨细胞主要分布于骨质表面与骨内血管通道周围的小陷窝内。破骨细胞主要的生理功能是溶解与吸收骨质，参与骨组织的重建和维持血钙的动态平衡。由于破骨细胞独特的功能，对破骨细胞的研究在阐明骨代谢性疾病的病理生理机制以及为疾病诊疗提供新方法中具有至关重要的意义。然而，破骨细胞是高代谢终末分化细胞，具有不能传代、存活时间短等特点，且破骨细胞在体内数量极少，难以分离获得。
目前，破骨细胞培养方法主要有：机械分离法、骨髓单核细胞诱导培养法、脾脏造血干细胞培养法以及血液单核细胞诱导分化培养法等；这些方法不可避免都要使用培养液对细胞进行培养，且不同的阶段采用不同配方的培养液进行，目前常见的原代细胞培养液多为含有血清的基础培养液，诱导过程中则选择添加诱导剂促使破骨细胞分化。然而，现有技术中诱导培养过程中所用的诱导剂单一简单，诱导分化破骨细胞的效果并不理想，因此，提供一种可高效获得破骨细胞的培养基是本领域亟待解决的一个技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种用于体外培养制备破骨细胞的培养基，以期通过改良培养基的组成从而提高破骨细胞的得率，为大量获得破骨细胞提供保障。
本发明的第二目的在于提供一种所述培养基的制备方法，以实现该培养基的快速制备。
本发明的第三目的在于提供一种利用所述的培养基制备破骨细胞的方法，该方法合理利用培养基，在不同的阶段采用不同的培养基，通过前期的提取纯化培养以及后续的诱导培养体外制备破骨细胞，简化了体外制备破骨细胞的流程。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种破骨细胞培养基，所述培养基包括：骨髓细胞培养基和诱导培养基；其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子10-40μg/L、含14-16％体积分数血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有20-70ng/mL RANKL、10-40ng/mL M-CSF、0.1-1μm/mL 1,25(OH)2D3、2-5ng/mL甲状旁腺激素、6-10ng/mL白细胞介素、2-8ng/ml肿瘤坏死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基础培养液。
本发明提供的培养基含有骨髓细胞培养基和诱导培养基，该两种培养基的基础组分均为细胞基础培养液，并且用于破骨细胞不同制备阶段细胞的培养，较为特殊的是，在骨髓细胞培养基中加入了特定含量的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和血清，M-CSF是一种具有谱系特异性的细胞因子。M-CSF为链间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，其对单核细胞的增殖、分化及维持其活性有重要促进作用，其次其在培养基中浓度选择合理，为骨髓间质单核细胞的大量增殖提供了先决条件，另外，经过实验验证，14-16％体积分数的血清对于形成体积大，胞浆丰满，细胞突起延展，细胞核呈圆形或椭圆形的培养细胞具有重要的促进作用。
在诱导培养基中，本发明创造性地加入了RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松等诱导因子，而且对各诱导因素在培养液中的浓度进行了限定，各诱导因子在协同的作用下，活使得经过前期培养获得的骨髓间质细胞能够大量地分化为破骨细胞，进而提高了破骨细胞的得率。
可选的，所述基础培养液包括α-MEM培养液，DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12中的一种或几种。
为了提供本发明的培养基的应用效果，基础培养液可以采用上述所列的多种成熟培养液，其中，综合考虑培养效果，以α-MEM培养液为优选基础培养液，在另一优选的方案中，基础培养液为DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12等体积的混合物。
可选的，所述血清为胎牛血清、马血清和羊血清中的一种或几种。
血清是很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
上述所列血清的主要成份有:
①蛋白质：是血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白、球蛋白。纤维粘连素细胞促进细胞附着；血清中巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用；胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。
②多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。
③激素：激素对细胞的作用是多方面的，胰岛素促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素能够促细胞增殖效应。血清中含有定量的氢化可的松，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用。
可选的，所述诱导培养基中，还含有体积分数占8-9％的胎牛血清。
基于上述血清对细胞增殖所具备的促进作用，本申请中，在诱导培养基中也优选加入体积分数占8-9％的胎牛血清，鉴于细胞密度高时，血清中的氢化可的松可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化，因此，本申请诱导培养基中所加入的胎牛血清的体积分数为8-9％。
可选的，所述诱导培养基中，所述白细胞介素包括白细胞介素-1和白细胞介素-6。
可选的，所述诱导培养基中，所述白细胞介素-1与所述白细胞介素-6的浓度比为1-3。
白细胞介素的种类繁多，且功能非常复杂，在本申请中，优选白细胞介素-1和白细胞介素-6，该两种白细胞介素(尤其是其浓度比为1-3)时，可与诱导培养基中的其他诱导因素产生协同效果，共同促进破骨细胞的分化。
上述的破骨细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
配制基础培养液，并在基础培养液中先加入既定体积分数的血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为10-40μg/L，得到骨髓细胞培养基；
在另一基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各试剂达到预定浓度，得到诱导培养基。
上述的制备方法中，先制备基础培养液并且定量，然后在基础培养液中加入巨噬细胞集落刺激因子以及血清，或者在基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，实现培养基的制备，需要指出的是，本发明提供的培养基的组分是预先混在一起的，因此在未使用时，应在低温条件下保藏，防止其失去活性。
可选的，所述RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松依次序先后加入。
一种根据所述的破骨细胞培养基培养破骨细胞的方法，包括以下步骤：
1)、将骨髓血细胞加入到骨髓细胞培养基中培养后，离心，并将所得的沉淀利用α-MEM培养液重悬，得到细胞悬液；
优选的，骨髓细胞的提取可以采用如下操作进行：
在无菌条件下取动物个体的骨，并且去除骨组织上的肌肉和软组织，随后剪开骨的两端后利用骨髓细胞培养基将骨髓从一端吹下，反复消化清洗后，继续加入一定量的骨髓细胞培养基培养预定时间，然后进行离心，离心后的沉淀利用α-MEM培养液重悬。
2)、将所述细胞悬液纯化；
得到的细胞悬液由于其含有杂细胞较多，因此需要纯化去除杂细胞，纯化过程一般采用培养基筛选的办法，使得目的细胞增殖，杂细胞被除去。
3)、将纯化后的细胞接种至细胞培养板中，并在细胞培养板中加入诱导培养基进行培养，并每隔1-2天换液一次，得到分化的破骨细胞。
可选的，在步骤1)中，所述离心的条件为800-1200转/分钟，离心的时间为5-8分钟。
可选的，在步骤2)中，所述纯化具体包括：
将细胞悬液用α-MEM培养液稀释到所需浓度，接种于培养板上，在35-37℃的CO2孵箱内培养20-25分钟，再用α-MEM培养液洗去未贴壁细胞，得到纯化后细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、破骨细胞体外培养是研究骨吸收的基础，如何获得纯度高，数量多的破骨细胞仍是目前该项研究的热点，本发明提供的通体外培养破骨细胞的培养基以及培养方法，通过对培养基的组分进行特定的选择，对骨髓中细胞分步进行培养纯化以及诱导，实现快速大量制备破骨细胞的效果。
(2)、本发明提供的培养基组分合理优化，利于细胞的大量增殖和分化，为建立完善的体外破骨细胞培养体现提供了先决基础。
(3)、本发明提供的这种体外破骨细胞的培养体现，实现了方法与培养基的结合，整个培养方法简化，可控性强，通过提供培养基的方式实现即可在短时间内(不到7天)即可获得大量多核、高活性的破骨细胞的制备。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的实施例中，提供了一种破骨细胞培养基，所述培养基包括：骨髓细胞培养基和诱导培养基；其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子10-40μg/L、含14-16％体积分数血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有10-70ng/mL RANKL、10-40ng/mL M-CSF、0.1-1μm/mL 1,25(OH)2D3、2-5ng/mL甲状旁腺激素、6-10ng/mL白细胞介素、2-8ng/mL肿瘤坏死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基础培养液。
更为优选的，在上述方案的基础之上，本发明的技术方案还可以包括以下一种或者多种限定，所述基础培养液包括α-MEM培养液，DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12中的一种或几种。所述血清为胎牛血清、马血清和羊血清中的一种或几种。或者，所述诱导培养基中，还含有体积分数占8-9％的胎牛血清。优选的，所述诱导培养基中，所述白细胞介素包括白细胞介素-1和白细胞介素-6。更为优选的，所述诱导培养基中，所述白细胞介素-1与所述白细胞介素-6的浓度比为1-3。
本发明提供的上述的破骨细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：配制基础培养液，并在基础培养液中先加入既定体积分数的血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为10-40μg/L，得到骨髓细胞培养基；在另一基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各试剂达到预定浓度，得到诱导培养基。
另外，为了保证所制成的诱导培养基的活性，所述RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松依次序先后加入。
根据所述的破骨细胞培养基培养破骨细胞的方法，包括以下步骤：将骨髓血细胞加入到骨髓细胞培养基中培养后，离心，并将所得的沉淀利用α-MEM培养液重悬，得到细胞悬液；将所述细胞悬液纯化；将纯化后的细胞接种至细胞培养板中，并在细胞培养板中加入诱导培养基进行培养，并每隔1-2天换液一次，得到分化的破骨细胞。
另外，优选的，所述离心的条件为800-1200转/分钟，离心的时间为5-8分钟。所述纯化具体包括：将细胞悬液用α-MEM培养液稀释到所需浓度，接种于培养板上，在35-37℃的CO2孵箱内培养20-25分钟，再用α-MEM培养液洗去未贴壁细胞，得到纯化后细胞。
接下来，本发明对于破骨细胞体外培养基及其制备方法举出以下具体实施例，具体请参考实施例1-实施例6。
实施例1
本实施例提供的破骨细胞培养基及其制备方法如下：
破骨细胞培养基包括骨髓细胞培养基和诱导培养基；两种培养基中，基础培养液(α-MEM培养液)均为500mL。其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子10μg/L、含14％体积分数胎牛血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有10ng/mL RANKL、35ng/mL M-CSF、0.1μm/mL 1,25(OH)2D3、2ng/mL甲状旁腺激素、6ng/mL白细胞介素、2ng/mL肿瘤坏死因子α、8ng/mL前列腺素E2和2ng/mL地塞米松的基础培养液。
制备方法：
配制基础培养液，并在基础培养液中先加入既定体积分数的胎牛血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为10μg/L，得到骨髓细胞培养基；在另一基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各试剂达到预定浓度，得到诱导培养基。
实施例2
本实施例提供的破骨细胞培养基及其制备方法如下：
破骨细胞培养基包括骨髓细胞培养基和诱导培养基；两种培养基中，基础培养液(α-MEM培养液)均为500mL。其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子30μg/L、含15％体积分数马血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有68ng/mL RANKL、37ng/mLM-CSF、0.5μm/mL1,25(OH)2D3、3ng/mL甲状旁腺激素、8ng/mL白细胞介素、5ng/mL肿瘤坏死因子α、10ng/mL前列腺素E2和4ng/mL地塞米松的基础培养液。
制备方法：
配制基础培养液，并在基础培养液中先加入15％体积分数的马血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为30μg/L，得到骨髓细胞培养基；在另一基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各试剂达到预定浓度，得到诱导培养基。
实施例3
本实施例提供的破骨细胞培养基及其制备方法如下：
破骨细胞培养基包括骨髓细胞培养基和诱导培养基；两种培养基中，基础培养液(α-MEM培养液)均为500mL。其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子35μg/L、含16％体积分数胎牛血清的基础培养液；所述诱导培养基含有70ng/mL RANKL、40ng/mL M-CSF、1μm/mL 1,25(OH)2D3、5ng/mL甲状旁腺激素、10ng/mL白细胞介素、8ng/mL肿瘤坏死因子α、12ng/mL前列腺素E2和5ng/mL地塞米松的基础培养液。
制备方法：
配制基础培养液，并在基础培养液中先加入15％体积分数的胎牛血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为35μg/L，得到骨髓细胞培养基；在另一基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各试剂达到预定浓度，得到诱导培养基。
实施例4
本实施例提供的破骨细胞培养基及其制备方法如下：
破骨细胞培养基包括骨髓细胞培养基和诱导培养基；两种培养基中，基础培养液(等体积比的DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12)均为500ml。其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子30μg/L、含15％体积分数(等体积比的胎牛血清、马血清和羊血清)的基础培养液；所述诱导培养基为含有66ng/mLRANKL、38ng/mLM-CSF、0.5μm/mL1,25(OH)2D3、4ng/mL甲状旁腺激素、8ng/mL白细胞介素、6ng/mL肿瘤坏死因子α、10ng/mL前列腺素E2、含8％体积分数和4ng/mL地塞米松的基础培养液。
制备方法：
配制基础培养液，并在基础培养液中先加入既定体积分数的血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为30μg/L，得到骨髓细胞培养基；在另一基础培养液中加入培养基其他组份，使得各试剂达到预定浓度或体积含量，得到诱导培养基。
实施例5
本实施例提供的破骨细胞培养基及其制备方法如下：
破骨细胞培养基包括骨髓细胞培养基和诱导培养基；两种培养基中，基础培养液(α-MEM培养液)均为500mL。其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子28μg/L、含15％体积分数胎牛血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有68ng/mLRANKL、38ng/mLM-CSF、0.5μm/mL1,25(OH)2D3、3ng/mL甲状旁腺激素、2ng/mL白细胞介素-1、6ng/mL白细胞介素-1、4ng/mL肿瘤坏死因子α、10ng/mL前列腺素E2、3ng/mL地塞米松和占基础培养液体积分数为9％的胎牛血清的基础培养液。
制备方法：
配制基础培养液，并在基础培养液中先加入既定体积分数的胎牛血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为28μg/L，得到骨髓细胞培养基；在另一基础培养液中加入各试剂，使得各试剂达到预定浓度，得到诱导培养基。
本发明提供的这种快速大量制备破骨细胞的方法具体包括如下的步骤：
试验例
利用上述实施例1-5提供的培养基进行体外破骨细胞的培养，培养方法按照以下操作进行。
1)、将骨髓血细胞加入到骨髓细胞培养基中培养后，800-1200转/分钟，离心5-8分钟，并将所得的沉淀利用于沉淀5倍体积的α-MEM培养液重悬，得到细胞悬液；
2)、将细胞悬液用α-MEM培养液稀释后接种于培养板上，在35-37℃的CO2孵箱内培养20-25分钟，再用α-MEM培养液洗去未贴壁细胞，得到纯化后细胞；
3)、将纯化后的细胞接种(接种密度为1.6×103个/cm2)至细胞培养板中，该细胞培养板中事先加入置入牛骨片以及玻片，并在细胞培养板中加入各实施例中的诱导培养基中进行培养，并每隔1天换液一次，培养5天之后采用TRAP的方法进行染色，并采用倒置荧光显微镜进行观察和计数，具体的统计结果如下表1所示：
表1 试验例1细胞计数结果和骨吸收陷窝情况
综上所述，本发明提供的通过体外培养破骨细胞的培养基以及培养方法，通过对培养基的组分进行特定的选择，对骨髓中细胞分步进行培养纯化以及诱导，实现快速大量制备破骨细胞的效果，实现了方法与培养基的结合，整个培养方法简化，可控性强，通过提供培养基的方式实现即可在短时间内(不到7天)获得大量多核、高活性的破骨细胞的制备。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。