本发明属于植物培养基
技术领域：
，具体涉及一种红景天细胞培养基。背景内容长鞭红景天RhodiolafastigiataS.H.Fu为景天科(Crassulaceae)红景天属RhodiolaL.植物，其根及根茎主要含有红景天苷等次生代谢产物，具有抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗微波辐射及抗肿瘤等功效，是极具开发前景的环境适应药物之一，亦是我国传统名贵药材珍品。由于受到需求递增、生态环境日渐退化双重因素的影响，红景天野生资源正日益稀竭，部分物种几近灭绝。红景天组织培养经过了几十年的研究虽有很大的进展，但还满足不了红景天的进一步开发利用的需要。获得高产细胞系是实现长鞭红景天大规模生产的前提，而细胞系的获得往往需要一种细胞培养基。而目前对红景天培养基的研究主要集中在愈伤组织的培养及芽诱导培养，如中国专利申请(CN101831398A)公布了一种添加二甲基亚砜的长鞭红景天芽诱导培养基及制法和用途，技术方案为：向配制MS基本培养基的溶液中加入细胞分裂素BAP溶液和生长素NAA溶液，混合均匀，用无机酸或无机碱调节混合液的pH为5.6～5.8，高温湿热灭菌后加入经过滤除菌的二甲基亚砜，混合均匀，得到每升MS基本培养基中含有细胞分裂素BAP的浓度为1μmol·L-1～20μmol·L-1，生长素NAA的浓度为0.1μmol·L-1～5μmol·L-1，二甲基亚砜的浓度为0.001mL·L-1～20mL·L-1。中国专利申请(CN101773070A)公开了一种红景天愈伤组织培养方法，它包括如下步骤：植物体的选择及无菌处理、愈伤组织诱导培养和大规模培养三个环节，其核心技术是愈伤组织诱导培养，是在基本培养基MS添加蔗糖0-50g/L，琼脂0-10g/L，α-萘乙酸0.1-5.0mg/L，6-苄氨基嘌呤0.1-5.0mg/L的基础上，加入非生物诱导子硝普钠SNP和硝酸银。因此，目前亟需一种红景天细胞培养基，为获得高产红景天细胞系提供基础，有助于红景天大规模培养和次级代谢物的大量生产。技术实现要素：为获得红景天高产细胞系，实现红景天大规模培养和次级代谢物的大量生产，本发明提供了一种红景天细胞培养基。本发明培养基能显著提高红景天细胞生物量和红景天苷的积累量，并且培养基成分简单，生产成本低，可达到产业化水平，能够实现红景天的大规模生产。本发明红景天细胞培养基是通过以下技术方案实现的：一种红景天细胞培养基，基础培养基中主要添加由以下成分及其终浓度：蔗糖20-40g/L，6-苄氨基嘌呤1-5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.05-0.15mg/L，α-萘乙酸0.1-0.5mg/L，酪醇1-20mmol/L，硝酸银10-80μmol/L，硝酸铵10-80μmol/L。优选地，基础培养基中添加由以下成分及其终浓度：蔗糖32g/L，6-苄氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸银68μmol/L，硝酸铵32μmol/L。优选地，所述培养基初始pH为5.7-5.9。优选地，所述基础培养为MS培养基或B5培养基。优选地，所述红景天细胞培养基适用于细胞悬浮培养体系。本发明红景天细胞培养基根据红景天细胞生长特性，经过大量实验筛选得到本发明培养基组成成分及其浓度。碳源的形式和质量浓度对愈伤组织细胞的生长和次生代谢产物的量有明显影响，一般采用蔗糖、果糖和葡萄糖作为碳源。本发明技术人员选择了蔗糖作为红景天细胞生长所需的碳源，确定了蔗糖浓度的使用范围，并筛选得到了最佳的使用浓度为32g/L。激素是调节植物细胞生长发育和代谢产物形成的主要物质，在本发明培养基中，6-苄氨基嘌呤，2,4-二氯苯氧乙酸和α-萘乙酸相互作用，并在相应的浓度范围内能够起到促进红景天细胞生长和红景天苷等次级代谢物的产生。本发明技术人员发现，在细胞培养基中加入酪醇能够促进红景天苷的形成。经过实验证明当初始培养基中酪醇浓度为1-20mmol/L时，促进红景天苷形成效果明显，其中酪醇浓度为12mmol/L时效果最佳。氮元素不仅是植物细胞的重要组成元素，也是一些次级代谢产物的组成元素，如生物碱。虽然，红景天苷中不直接含有N元素，但因其为苯丙氨酸的衍生物，故氮素供应的形式以及作用质量浓度从理论上讲都可以影响红景天苷的代谢。NH4+/NO3-的比值和量与植物细胞生长和次生代谢累积关系密切，本发明技术人员发现，当细胞培养基中NH4+/NO3-比值为1:2.5时，对红景天苷的合成促进作用最大。本发明红景天细胞培养基与现有培养基相比，具有以下优势：(1)本发明培养基中培养得到的红景天细胞生物量是对比例培养基中的2.5倍，红景天苷的积累量是对比例培养基中的3.6倍，本发明红景天细胞培养基对红景天细胞生长和次级代谢物的积累具有突出的作用效果。(2)本发明红景天细胞培养基成分简单，生产成本低，可达到产业化水平，能够实现红景天的大规模生产。附图说明图1：实施例1-3及对比例1-3培养基中红景天细胞的生物量比较。图2：实施例1-3及对比例1-3培养基培养得到的愈伤组织颗粒中红景天苷的含量的比较。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1一种红景天细胞培养基一种红景天细胞培养基，其向基础培养基MS中添以下成分及其终浓度：蔗糖32g/L，6-苄氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸银48μmol/L，硝酸铵32μmol/L。红景天细胞培养基的制备方法：称取相应质量的蔗糖，6-苄氨基嘌呤，2,4-二氯苯氧乙酸，α-萘乙酸，酪醇，硝酸银，硝酸铵依次加入到MS培养基中，搅拌均匀，将pH调整至5.8，120℃灭菌20min，即得。实施例2一种红景天细胞培养基一种红景天细胞培养基，其向基础培养基MS中添以下成分及其终浓度：蔗糖20g/L，6-苄氨基嘌呤1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，α-萘乙酸0.1mg/L，酪醇1mmol/L，硝酸银10μmol/L，硝酸铵10μmol/L。制备方法与实施例1类似。实施例3一种红景天细胞培养基一种红景天细胞培养基，其向基础培养基B5中添以下成分及其终浓度：蔗糖40g/L，6-苄氨基嘌呤5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.15mg/L，α-萘乙酸0.5mg/L，酪醇20mmol/L，硝酸银80μmol/L，硝酸铵80μmol/L。制备方法与实施例1类似。对比例1一种红景天细胞培养基一种红景天细胞培养基，其向基础培养基MS中添以下成分及其终浓度：蔗糖50g/L，6-苄氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸银48μmol/L，硝酸铵32μmol/L。制备方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，培养基中蔗糖浓度为50g/L。对比例2一种红景天细胞培养基一种红景天细胞培养基，其向基础培养基MS中添以下成分及其终浓度：蔗糖32g/L，6-苄氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇24mmol/L，硝酸银48μmol/L，硝酸铵32μmol/L。制备方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，培养基中酪醇浓度为24mmol/L。对比例3一种红景天细胞培养基一种红景天细胞培养基，其向基础培养基MS中添以下成分及其终浓度：蔗糖32g/L，6-苄氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸银32μmol/L，硝酸铵32μmol/L。制备方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，培养基中NH4+/NO3-比例为1:2。试验例1细胞生物量的测定以长鞭红景天实生苗幼茎作为外植体诱导产生愈伤组织，生长旺盛的愈伤组织继代培养20天分别加入实施例1-3、对比例1-3制备得到的培养基中，建立细胞悬浮培养体系。细胞悬浮培养系每隔10天继代1次。培养基初始pH为5.8。培养室内光周期为14h/d，培养温度为24℃，摇床转速为110r/min。将上述试验例1收获得到的各小细胞团分别用5倍体积的蒸馏水充分洗涤3次，抽干表面水分，称其鲜质量，后于60℃烘箱中烘至恒质量，放入干燥器内冷却，称其干质量。具体结果如表1所示。表1不同培养基中细胞生物量的变化培养基细胞生物量(g/L)实施例132.5±1.25实施例228±0.89实施例327±0.65对比例113±1.22对比例215±0.37对比例320±0.87由表1可知，利用实施例培养基得到的红景天细胞量明显高于对比例培养基，其中实施例1培养基中得到的细胞生物量是对比例1中的2.5倍。由此可知，本发明红景天细胞培养基能明显促进红景天细胞的生长。各培养基中细胞生物量的比较如图1所示。试验例2红景天苷的提取及测定将各培养基培养得到的长鞭红景天愈伤组织颗粒65℃烘干至恒质量，粉碎(过40目筛)，75％乙醇浸提12h，后于90℃水浴中回流提取40min，加入5倍红景天体积75％乙醇。提取液用4层纱布滤过。滤液减压蒸馏(70℃，7kPa)除去大部分乙醇，上AB-8树脂柱，20％乙醇洗脱，洗脱体积流量为5mL/min，收集洗脱液再经二次减压蒸馏(70℃，7kPa)除去大部分乙醇，冷冻干燥，得浅棕色固体，待用。HPLC法测定红景天苷量，结果如表2所示。表2不同培养基愈伤组织中红景天苷的含量培养基红景天苷的含量(红景天苷量/细胞干质量mg/g)实施例123.4±0.39实施例219.7±0.57实施例317.2±0.91对比例16.5±0.43对比例28.6±0.64对比例37.8±0.32由表2可知，利用实施例培养基得到的组织中红景天苷含量明显高于对比例培养基，其中实施例1培养基中得到的是对比例1中的3.6倍。由此可知，本发明红景天细胞培养基能明显促进红景天细胞中次级代谢物红景天苷的生成。各培养基愈伤组织中红景天苷的含量比较如图2所示。当前第1页1 2 3