一种用于可见光致体外培养的细胞/细胞薄层收割的硅/石墨烯基复合表面及其制备方法与流程

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种用于可见光致体外培养的细胞/细胞薄层收割的硅/石墨烯基复合表面及其制备方法。

背景技术：

“细胞片层组织工程技术”一经提出，就在组织工程修复及重建及细胞治疗过程中，作为一种新的可构建三维组织及器官中表现出巨大潜力。细胞片层不仅保存组织所必需的细胞表面蛋白、细胞间连接蛋白及细胞外基质环境，还可提供促进细胞和组织再生的生物活性因子。目前，层层堆叠细胞片层组织工程技术被用于治疗许多疾病(心脏、肝脏及泌尿系统等)，并表现出光明的前景。因此，高效获取完整的高活性及功能性的细胞片层对于细胞片层组织工程来说是关键问题。目前，大多数的细胞片层获取都是采用温敏系统，而其存在的问题在于长时间的低温会在一定程度上损伤细胞功能，并会促使一些非相关基因错误表达。同时，温敏基板制备过程复杂，价格昂贵，也是限制其在组织工程应用的另一个重要因素。因此，如何低成本的、高效的、易操纵的实现细胞片层收割对细胞片层技术的发展非常关键。

洪逸等采用光敏半导体二氧化钛通过紫外光照改变材料表面的亲疏水性成功获得细胞片层(yihong,etal.light-inducedcelldetachmentforcellsheettechnology,biomaterials,34(2013)11-18)。但是，紫外光对细胞存在一定的毒性并可能造成基因突变，故这种方法也存在一定缺陷。因此，利用可见光实现细胞脱附受到关注。

太阳能是人类取之不尽的清洁能源，太阳能电池材料即对可见光敏感，并可将其转化为电。因此，如何将可见光相应的材料利用到可调控蛋白及细胞行为上，是一个值得研究的课题。本课题组之前利用可见光响应的si(p/n)结基板及钙钛矿薄膜器件作为细胞培养表面，光照后基板表面积累负电荷实现吸附蛋白的脱附并最终获取细胞片层(106085948a，106047692a)。因此，表面光生电荷的积累会对蛋白的吸附状态进行调控。生理条件下，蛋白带负电，并与基板相互总用。有研究表明，当表面电性反转(由负转正)，蛋白的稳定性下降，与基板的连接可能会受到破坏，蛋白稳定的折叠状态及疏水键被打破，蛋白的多肽链可能会发生重排(cnickpace，etal,charge-chargeinteractionsinfluencethedenaturedstateensembleandcontributetoproteinstability)。因此，制备光生正电荷积累的表面去调控蛋白的吸附状态，从而获取细胞片层值得研究。

本发明选取可见光生正电荷的带有肖特基结的si/gr复合薄膜作为细胞培养表面，通过可见光的强弱、光照时间、si的掺杂浓度及细胞的种类等来调控光敏材料对可见光的响应及表面光生正电荷的数量，研究可见光下带正电的gr表面与吸附蛋白及细胞或细胞与细胞之间的相互作用，对于细胞片层脱附、组织工程、细胞治疗等的发展都有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于可见光致体外培养的细胞/细胞薄层收割的硅/石墨烯(si/gr)基复合表面及其构建方法，该si/gr基复合表面是典型的“三明治”结构，可有效吸收可见光，并通过肖特基结将电子和空穴分离，使gr表面带正电，此外该复合表面具有良好的细胞相容性。利用该si/gr基复合表面作为细胞培养表面，在可见光照射下gr表面带正电使得表面吸附的蛋白层脱附，最终高效温和的获取低损伤的完整细胞片层。

本发明的一种用于可见光致体外培养的细胞/细胞薄层收割的硅/石墨烯(si/gr)基复合表面采用典型的“三明治”结构，所述的si/gr基复合表面自下而上依次包括si基板、单层gr及蛋白层，所述的si/gr具有肖特基结，所述的si基板为n型掺杂；所述的蛋白层为胎牛血清、牛血清白蛋白、纤连蛋白或胶原蛋白层。

优选地，其si基板厚度为100～1000μm，si基板晶面为(100)或(111)，si基板掺杂浓度为5×10¹⁵～1×10¹⁸/cm³；所述gr的厚度为0.3～0.4nm；所述的蛋白层为胎牛血清、牛血清白蛋白、纤连蛋白或胶原蛋白，可通过物理吸附制备得到。

本发明的一种用于可见光致体外培养的细胞/细胞薄层收割的硅/石墨烯(si/gr)基复合表面的构建方法如下：利用机械转移的方法将一层gr转移到洁净的si基板的抛光面，干燥后在氩气环境下500摄氏度保温60min，烧掉gr层的有机物，将所得si/gr用水和乙醇清洗干净，将样品放入蛋白溶液中浸泡0.5～24h，在gr层上物理吸附获得蛋白层，所述的蛋白溶液为胎牛血清、牛血清白蛋白溶液、纤连蛋白溶液、胶原蛋白溶液。所述的蛋白溶液浓度通常为0.1～10mg/ml。

利用上述的硅/石墨烯(si/gr)基复合表面进行可见光致细胞收割的方法，是以si/gr基复合表面作为细胞培养表面接种细胞并进行细胞体外培养，再采用可见光照射该培养表面，gr表面带正电使吸附蛋白脱附，最终细胞及细胞片层从上述器件表面脱附。

所述细胞为在体外模拟生理环境下培养的贴壁细胞，包括成骨细胞、成纤维细胞、成肌细胞、上皮细胞、内皮细胞或骨髓间充质干细胞。

上述方法具体包括以下步骤：

a.在进行体外细胞培养前，将所述的si/gr基复合表面以紫外光照或蒸气消毒方式消毒；

b.将上述复合表面作为体外细胞培养表面，在其表面以2×10⁴～2×10⁶个/cm²的密度种植细胞，加入细胞培养基，并放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1～10天；

c.将经上述培养后的培养表面移入pbs中，以波长为400～800nm、强度30～300mw/cm²的可见光照射上述si/gr复合薄膜1～20min，即可使培养后的细胞或细胞薄层脱附。

本发明的方法选择在可见光照射下存在光生正电的si/gr基复合表面，其可以高效的吸收可见光并实现电子空穴高效分离，使gr表面带正电，在细胞培养过程中将该器件作为细胞培养表面，所培养的细胞在经可见光照射后，带正电的gr表面诱发吸附蛋白脱附，使得细胞自发从培养器具表面脱离，实现细胞脱附。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明所用的si/gr基复合表面利用gr表面光生正电实现细胞/细胞片层的脱附，避免了传统酶解法细胞脱附时对细胞功能造成的损伤，具有高效的、低损伤、操作简便并且适用细胞范围广等特点，具有很强的实用性。对于散在的细胞，可使85％以上的细胞脱附；对于细胞薄层，则可使细胞薄层完整脱附。本发明细胞培养表面所需的si/gr基复合材料成本低，易于实现，便于推广应用。

附图说明

图1为实施例2中细胞脱附流程图；

图2为实施例2中光致脱附细胞片层的活染色荧光图。

图3为实施例2中光致脱附细胞片层的死染色荧光图；

图4为光学显微镜获得的细胞片层再迁移荧光图片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

购买n型的单晶si片，单层gr经过机械转移的方法制备于si基板表面，获得含有肖特基结的si/gr基复合表面，将制备好的si/gr基复合表面放入蛋白溶液中浸泡，得到物理吸附的蛋白层。并以此复合表面膜作为细胞培养表面，进行下列培养。si基板的厚度为100～1000μm，晶面为(100)及(111)，掺杂浓度为5×10¹⁵～1×10¹⁸/cm³，单层gr的厚度为0.3～0.4nm，复合薄膜表面为单层gr。

实施例1

在洁净的si基板的抛光面采用机械转移的方法制备一层gr，干燥后在氩气环境下500摄氏度保温60min，将所得si/gr用水和乙醇清洗干净，将样品放入0.1mg/ml的胎牛血清蛋白溶液中浸泡0.5h，在gr层上物理吸附获得蛋白层，得到si/gr基复合薄膜。在上述si/gr基复合薄膜表面，进行成骨细胞体外培养，接种密度为2×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400～800nm、强度30mw/cm²的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射20min，即可使95％细胞从表面脱离。

实施例2

在实例1所述的si/gr基复合薄膜表面，进行成骨细胞体外培养，接种密度为1×10⁵个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养培养7天后，细胞形成膜片，以波长为400～800nm、强度50mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10min，即可使细胞片层从表面脱离。图1为采用nikon相机所观察到的实施例2中培养细胞片层脱附的过程。可以看出经可见光照射后整个细胞片层实现完整脱附。图2、3分别为实施例2中光致脱附后的细胞片层的活/死细胞染色，可以发现脱附后的细胞片层保持了高的活性。

实施例3

在洁净的si基板的抛光面采用机械转移的方法制备一层gr，干燥后在氩气环境下500摄氏度保温60min，将所得si/gr用水和乙醇清洗干净，将样品放入1mg/ml的牛血清白蛋白溶液中浸泡6h，在gr层上物理吸附获得蛋白层。在上述si/gr基复合薄膜表面，进行成骨细胞体外培养，接种密度为5×10⁵个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养4天后，细胞形成膜片，以波长为400～800nm、强度100mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射8min，即可使细胞片层从表面脱离。图4为采用光学显微镜所观察到的实施例3中培养细胞片层在可见光照后脱附再培养1天和3天后的迁移图片。可以看出经可见光脱附后的细胞片层重新再培养后，能够很好的爬出新的细胞，并保持良好的细胞形态及活力，说明可见光脱附的细胞片层保持了良好的再迁移性能，这在组织工程中细胞片层的再应用是很关键的。

实施例4

在洁净的si基板的抛光面采用机械转移的方法制备一层gr，干燥后在氩气环境下500摄氏度保温60min，将所得si/gr用水和乙醇清洗干净，将样品放入10mg/ml的纤连蛋白溶液中浸泡24h，在gr层上物理吸附获得蛋白层。在上述si/gr基复合薄膜表面，进行成纤维细胞体外培养，接种密度为1×10⁶个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养3天后，细胞形成膜片，以波长为400～800nm、强度40mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射15min，即可使细胞片层从表面完整脱离。

实施例5

在洁净的si基板的抛光面采用机械转移的方法制备一层gr，干燥后在氩气环境下500摄氏度保温60min，将所得si/gr用水和乙醇清洗干净，将样品放入5mg/ml的胶原蛋白溶液中浸泡6h，在gr层上物理吸附获得蛋白层。在上述si/gr基复合薄膜表面，进行成肌细胞体外培养，接种密度为2×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养10天后，细胞形成膜片，以波长为400～800nm、强度200mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射5min，即可使细胞片层从表面完整脱离。

实施例6

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行上皮细胞体外培养，接种密度为8×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养7天后，细胞形成膜片，以波长为400～800nm、强度300mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射1min，即可使细胞片层从表面完整脱离。

实施例7

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行骨髓间充质干细胞体外培养，接种密度为1×10⁵个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养7天后，细胞形成膜片，以波长为400～800nm、强度50mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射6min，即可使细胞片层从表面完整脱离。

实施例8

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行内皮细胞体外培养，接种密度为1.5×10⁶个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养2天后，细胞形成膜片，以波长为400～800nm、强度150mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射3min，即可使细胞片层从表面完整脱离。

实施例9

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行成纤维细胞体外培养，接种密度为5×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400～800nm、强度30mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射5min，85％细胞从基板表面脱离。

实施例10

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行成肌细胞体外培养，接种密度为4×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400～800nm、强度50mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射20min，91％的细胞从基板表面脱离。

实施例11

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行上皮细胞体外培养，接种密度为6×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400～800nm、强度100mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10min，97％的细胞从基板表面脱离。

实施例12

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行骨髓间充质干细胞体外培养，接种密度为5×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400～800nm、强度300mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射8min，95％的细胞从基板表面脱离。

实施例13

在实例5所述的si/gr基复合薄膜表面，进行内皮细胞体外培养，接种密度为2×10⁴个/cm²，放入37摄氏度恒温及5％二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400～800nm、强度200mw/cm²可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射1min，85％的细胞从基板表面脱离。