一种用于培养细胞的载体的制作方法

本发明涉及细胞培养领域，一种用于细胞培养的载体。

背景技术：

细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特征和功能的技术。来自于动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的，必须贴附在合适的固体介质上并铺展，才能开始生长。

传统的细胞培养是使用细胞培养皿进行培养，培养皿经过处理适于细胞贴附和生长，一个传统的培养皿提供了78.52cm²并可以可支持10⁶-10⁷个细胞贴附生长。随后，人们开始使用细胞转瓶，滚瓶、以及中空纤维等装置进行细胞培养。此种方法工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批间差异大，且容易造成污染，耗时耗力，并不能满足现今社会上对细胞产物大批量培养的需求。

微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、透明的小颗粒。能使贴壁依赖性细胞贴附在颗粒表面进行悬浮培养，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。

最早使用微载体培养技术的是1967年Van Wezel利用离子交换凝胶(DEAE-Sephadex A50)作为载体，轻微搅动即可使该离子交换凝胶成为微小的颗粒悬浮在培养基中，由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖，而且载体处于悬浮状态不仅可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。

微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，由于其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，且放大容易，已广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞等。良好的细胞培养微载体具有以下特点：表面积/体积(S/V)大，单位体积培养液的细胞产率高；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高；容易进行放大培养；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；培养系统占地面积和空间小。目前已开发了多种商业化的微载体，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳质微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。

大规模的细胞培养是通过哺乳动物细胞培养生产病毒疫苗或蛋白产品的有效途径。贴壁依赖性细胞贴附在微载体上利用生物反应器悬浮培养成为迄今最常用、最有效的细胞大规模培养模式之一。

目前市场上使用的商品化微载体主要有：如GE公司的CytodexⅠ、CytodexⅡ、CytodexⅢ和Thermo公司的Cytopore，Cytoline，Biosilon、CultispherG等，以上的微载体因为其制作需要经过多种生物反应溶剂、高分子聚合物材料以及添加剂、还原剂等相互反应、中和以及清洗，工序繁多，工艺复杂，所以价格昂贵，目前的市场价已达每公斤3-10万元人民币，还时常出现供货不及时的现象。而且由于此类微载体的尺寸在几微米到几百微米不等，体积微小，在细胞大规模培养时需要大量的微载体置入反应器内，容易造成微载体堆积，使得相连的微载体之间的空隙很小，细胞生长密度比较大，在底部及中心部位的细胞就很难获得细胞增殖所需的充足养分，以及影响细胞消耗过的废物排放，使得细胞的生长环境和生长状态变差，容易造成底部的细胞生长缓慢甚至死亡。受损死亡的细胞从载体上脱落进而影响其它细胞的生长。如果是干细胞，则更容易产生非特异性分化。

因此，开发出细胞培养领域中适合于多种动物细胞大规模培养所用的载体，具有广泛的应用前景，对促进生物反应器载体大规模细胞培养技术的发展具有重要的历史意义。

本发明的目的是为生物细胞的增殖培养提供一种生长载体，使其可以拥有更大的细胞吸附生长空间，并在载体之间的空隙形成适合细胞生长的微环境，可以大规模培养所需的细胞。并随着培养容器或者反应器的运动实现搅拌培养基的功能，避免由于传统的反应器采用机械式搅拌原理而产生剪切力，从而造成细胞受损，甚至死亡。

此外，也可以给载体增加可磁化物质，使之可以通过外部磁场控制载体的运动、分布以及状态，实现更均匀的搅拌培养基液体和形成更优的细胞生长微环境。

本发明具有结构及制造工艺简单、操作方便等优点，适用于作为大规模培养生物细胞的生长载体。其特点是：将载体置入培养容器或者反应器中，通过磁场或者依靠其浮力或者重力，使得载体在培养容器或者反应器中上浮、下沉或者悬浮，并在此过程中搅动培养基溶液，使液体中的养分充分均匀化，可以为培养的悬浮细胞提供良好的代谢支持，并可以让贴壁细胞更容易吸附在载体上生长、增殖。

技术实现要素：

本发明公开了一种新型的用于细胞培养的载体。

本发明所涉及的一种新型的细胞培养的载体，其主要是由单一材料或混合物材料整体注塑成型为实芯或空芯形体，或由单一材料或混合物材料整体加工成型为实芯或空芯形体，或由外包表壳、内置芯物等构成实芯或空芯形体，或由载体主体、内置芯物、封盖等构成实芯或空芯形体。其特征在于，整个载体成型后形成一个密闭的整体，载体的尺寸值范围为：大于等于1mm，小于培养容器的内壁边长；这一特点使之明显不同于其它发明中的微载体，其主要是载体外壁提供给细胞附着生长、实现载体搅拌细胞培养容器里液体的功能并使悬浮细胞均匀分布。

以上所述的载体可由多个结构零件结合组成一个整体形体，各个零件采用二次或多次注塑连接成密封的整体，或采用胶水粘接成一个密封的整体，或采用超声波焊接成一个密封的整体，或在结构上采用过盈配合压合成一个密封的整体，或采用螺纹拧合成一个密封的整体，或采用激光烧结成一个密封的整体，或采用加热热熔成一个密封的整体等各种结合方式。

以上所述的载体是形状为球形或椭球形或圆饼形或拥有多边形轮廓的平滑无棱角物体。

以上所述的载体的最优的尺寸值范围为：大于等于1mm，但小于培养容器的内壁边长。

以上所述的载体的外壁表面可制作成光滑面，或可以制作成圆滑的凹凸曲面，或可以制作成波纹面等多种曲面形式。

以上所述的载体成型后的密度与培养基液体的密度比值应满足：0<d<2，d为载体密度与培养基液体密度比值，最优的比值范围为：0.95<d<1.05，以保证其在培养容器内的培养液里可凭自身浮力或重量实现上浮、下沉或悬浮在培养基液体中。

以上所述的内置芯物可由坡莫合金、硅铁软磁合金、四氧化三铁和铁、钴、镍及其合金等导磁性高的顺磁性金属材料制成。以保证载体在没有磁场的环境下，没有磁性，从而不会产生相互吸引聚集功能。而在有磁场的环境下，能受到磁力控制进行运动

以上所述的内置芯物可嵌在载体主体端面开口处，或可以放置在载体主体内的凹槽底部，将封盖嵌装在载体主体上部密封。

以上所述的内置芯物由单一的块状、片状或颗粒组成，或由多个块状、片状或颗粒组成，或由粉末组成，可以根据磁场方向运动。

以上所述的载体主体材质可以采用聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、PBS树脂、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、硝酸纤维、聚氨酯等塑料材质，也可以采用玻璃、陶瓷等非金属材质，还可以采用不锈钢等金属或者合金金属材质。

以上所述的载体在置入细胞培养容器内并培养细胞时，载体的尺寸值应满足x<L/2，其中x为载体的任意径长(如圆形珠子的直径，椭圆型珠子的最长径或最短径)，L为培养容器内部型腔中最短的两个边长中任意一个长度，在边长的尺寸能满足装入多个载体时，其尺寸值范围应满足以下公式：L/n>x>L/(n+1/2)；最佳的尺寸值范围为；L/(n+1/10)>x>L/(n+1/3)。n为载体的个数。

以上所述的载体可以在表面采用亲水或疏水处理，或表面附着温敏性分子聚合物等物质。

本发明相对于市场上现有的载体，具有以下一些优点：

①、本发明结构简单，加工制造方便，生产工艺简便，成本低，可以实现规模化、大批量的生产制造。

②、本发明由于加工及生产制造成本低，采用一次性使用方式培养细胞，无需重复多次使用，从而避免产生残留污染、清洗不便以及灭菌的问题。

③、本发明可以在细胞培养容器或反应器内，依靠磁场或者重量与培养基溶液的比重来实现上浮、下沉和悬浮的功能，以此在培养基溶液内实现搅拌的功能。

④、本发明由于其本体尺寸比较大，在1mm以上，可以在大规模细胞培养时，载体堆积后，能在载体之间形成较大的空间，满足悬浮细胞的生长以及细胞成长所需养分的交换。

本发明通过结构上的改进极大的提高了培养细胞的载体的生产制造成本，优化了细胞培养的难度，可以方便简捷地实现多种类型细胞的增殖，并可以规模化、大批量的培养细胞。

附图说明

图1为本发明单一材质球形载体的截面结构示意图。

图2为本发明空心球形导磁载体的截面结构示意图。

图3为本发明复合导磁球形载体的截面结构示意图。

图4为本发明表面处理球形载体的截面结构示意图。

具体实施方式

在下文中将参考以上的附图详细描述本发明的实施例，参考这些附图，其中在整个视图中，相似的参考特性指定为类似的或相应的部件。在本发明中的实施例中，哪些判断为能够令本发明的主旨造成不必要的模糊的公知性能和结构的详细描述被忽略掉。

以上所述的用于细胞培养的载体的实施例，是为了对本发明的进一步说明，不应理解为完全覆盖本发明所包括的内容。并且不用于限制所有容器结构件的材料的种类，以及在对于本实施例中所定义的所基本参数的限制。

实施例一：

如附图1所示的单一材质球形载体的截面结构示意图，单一材质的球形载体可包括：实心球形载体1和空心球形载体2。实心球形载体1其特征在于：采用聚苯乙烯或聚丙烯或聚碳酸酯或聚四氟乙烯等聚合物材料注塑或机械加工成为实心球体，也可采用或玻璃、陶瓷等非金属材质加工成为实心球体。球体的直径为6mm，由于其整体的密度比培养基液体的密度大，所以在反应器或培养容器内，该载体会沉降在培养基液体的底部。空心球形载体2其特征在于：采用聚苯乙烯或聚丙烯或聚碳酸酯或聚四氟乙烯等聚合物材料注塑或机械加工成为空心球体，也可采用或玻璃、陶瓷等非金属材质加工成为空心球体。球体的直径为6mm，由于其整体的密度比培养基液体的密度小，载体会悬浮在反应器或者培养容器中培养基液体的上面。在培养过程中，需要反应器或培养容器能实现转动或摆动，能够使载体上下或左右或按设定轨迹运动。

实施例二：

如附图2所示的空心球形导磁载体的截面结构示意图，其特征在于：主要由外壳1和内芯2构成。外壳1采用聚苯乙烯或聚丙烯或聚碳酸酯或聚四氟乙烯等聚合物材料做为中间为空芯的球体外壳，内芯2采用带有导磁性能的四氧化三铁或者硅钢片。内芯2置入在外壳1内部的空间内。整个球体的直径为6mm，内径空芯直径为4mm。载体通过置入四氧化三铁或者硅钢片的重量来控制整个载体的重量，使其整体的密度相对于培养基液体密度对比的大小来控制载体在培养基液体中上浮、悬浮或者下沉。使整个载体在有磁场的环境下，能够实现吸附细胞，并且载体能够吸附在反应器或培养容器的磁极端。载体在培养基液体中运动时，可起到搅拌培养基液体的作用，同时可以增大贴壁细胞的可增殖的表面积，提高培养的效率。

实施例三：

如附图3所示的复合导磁球形载体的截面结构示意图，其特征在于：主要由球盖1、封盖2、磁芯3和球体4构成。磁芯3置入球体4中间的空间内，再将封盖2盖在球体4上端面上，使球体4内的空间形成密闭的空间，再将球盖压住封盖2合在球体4上，使载体形成一个圆形的密闭整体。球盖1和球体4可由聚碳酸酯、聚丙烯、PBS树脂、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、硝酸纤维、聚氨酯等材料注塑成型。磁芯3采用可导磁的四氧化三铁或硅钢片制成。封盖2在不影响重量的情况下可以采用塑性材料注塑或者金属、非金属等材料加工制成。也可以用和磁芯3相同的材质，增大磁性。球盖1可以采用整体包裹封盖2注塑在球体4上；也可以采用超声波焊接在球体4上；也可以采用激光烧结使球盖1和球体4粘接在一起，形成一个密闭的载体；还可以采用整体加热，使球盖1和球体4熔接形成密闭的整体。载体在磁场环境下能够随磁场的变化而运动，从而能在反应器或培养容器中实现搅拌培养基液体的功能，并能作为贴壁细胞生长、增殖的附着物，使得细胞在同一环境下取得最大化的培养效果，提高效率。

实施例四：

如附图4所示的表面处理球形载体的截面结构示意图，其特征在于：主要由空心球体1和表面涂层2构成。空心球体1由混合有导磁性的材质制成，再在空心球体1表面附着一层无毒性的处理层。表面处理可以采用等离子亲水或疏水处理，也可以采用附着温敏性分子聚合物，也可以表面附着明胶或胶原蛋白等。处理过的载体表面无毒性，适合贴壁细胞生长、增殖。同时由于里层的空心球体1带有导磁性质，可以在反应器或培养容器中的磁场中运动，在搅拌培养基液体的同时，作为贴壁细胞的生长附着物，增大细胞培养的表面积，提高培养效率。

以上所述的载体的实施例，是为了对本发明在细胞培养中的进一步说明，不应理解为完全覆盖本发明所包括的内容。并且不用于限制所有载体结构件的材料的种类，以及在对于本实施例中所定义的所基本参数的限制。