一种三维重建观察细胞在载体内增殖分布的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及活体染料领域，更具体地，涉及一种长时间存留在细胞内部用于观察细胞在三维支架内部分布及数量变化的活体染料的新用途。
【背景技术】
[0002]自然界组织、器官及生物体细胞的基本形状均是三维立体形状。将细胞种植于载体内进行三维培养，研宄细胞之间的相互影响、细胞对各种信号应激或者细胞与支架的联系，已成为深入探索生命机制的重要方法和细胞研宄的必然趋势。然而，诸如免疫组化、普通光镜观察等传统的影像学技术不能对三维培养进行立体评估，如果破坏支架提取细胞后再检测又将影响细胞功能状态。所以运用影像学技术观察三维状态细胞非常重要。已经相继出现的有关技术，包括超声成像、核磁共振成像(MagneticResonance Imaging, MRI)、X线成像和核素成像等。这些成像技术不但需要专业的人员操作，可能有放射性，价格昂贵，而且它们的分辨率低(>1μπι)，不能够很好地观察细胞在支架内分布和生长。光学成像有效弥补了这一不足，它的分辨率相对较高(>0.1 μπι)，可以观察细胞及其亚结构，其中利用激光共聚焦显微镜对不同焦面扫描后重构出三维立体图形的成像技术容易实施，操作简单，成本低，使用安全，是较理想的成像方法。为了使细胞在激光共聚焦显微镜下成像，就需要对细胞进行着色，使其易于分辨。我们采用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyf luorescein diac-etate，succinimidyl ester, CFDA-SE，南京晶恩生物科技有限公司出产)对细胞着色。自从Lonys首次将CFDA-SE作为活体染料检测细胞以来，它被广泛地用于分析多种细胞如淋巴细胞、肿瘤细胞、干细胞等存活。其工作原理为:非极性分子CFDA-SE可以自由透过细胞膜进入细胞，被细胞内酯酶催化分解成羧基荧光素琥珀酰亚胺醋(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)，CFSE不可逆地与细胞内蛋白结合并荧光标记细胞内蛋白上，也不会被降解或者代谢，对细胞生理活动无明显影响。成熟细胞的荧光标记均匀稳定呈绿色，可持续两个月以上。细胞分裂后，荧光蛋白可以平均分配到子细胞中，荧光强度减半。通常用流式细胞仪进行分析动力学参数如分裂率、死亡率、进入第I代分裂时间、平均细胞周期等。CFDA-SE染色法相对于传统的测定细胞增殖染色法3H-TdR掺入法、MTT比色法优势明显，细胞用量少，操作简单，且可以分析单个细胞的增殖信息。
【发明内容】
[0003]本发明的任务是提供一种利用CFDA-SE染色观测三维培养细胞的方法，即一种三维培养光学成像方法，具体是一种经过CFDA-SE染色的细胞封装在载体内由激光共聚焦显微镜扫描后三维重建来观察细胞在载体内增殖、分布的方法。该方法简单快捷，仅需10分钟染色，价格便宜(相对荧光标记抗体)，可以连续观察2个月以上。
[0004]按照本发明，提供一种三维重建观察细胞在载体内增殖分布的方法，该方法过程为:将用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液溶解CFDA-SE，以5uM的终浓度加入到目的细胞悬液中染色，37°C孵育6-15分钟，洗涤后将染色后的细胞封装在载体内构建三维培养体系，在不同时间点对该三维培养体系不同层面行激光共聚焦扫描并三维重建，得到仅有绿色球形荧光的重建图。
[0005]实现本发明的具体方案是:
[0006]本发明提供的三维重建观察细胞在载体内增殖分布的方法，包括以下步骤:
[0007]步骤一、细胞染色:用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液溶解CFDA-SE，以5微摩尔每升(μΜ)的最终浓度加入到目的细胞悬液中染色，37°C孵育6-15分钟，洗涤去除残余的染色剂后得到着色目的细胞；
[0008]步骤二、构建三维培养体系:将着色目的细胞封装在载体(如水凝胶、蛋白质、基质等)内构建三维培养体系；
[0009]步骤三、激光共聚焦显微镜三维重建:在不同时间点对该三维培养体系不同层面行激光共聚焦显微镜扫描并进行三维重建，得到仅有绿色球形荧光的能直接观察目的细胞在载体内分布的重建图。
[0010]步骤三中所述的三维重建是利用NIS Elements Viewer 3.20图像采集及处理软件进行的三维重建。
[0011 ] 步骤三所得到的重建图可以是用CFDA-SE染色细胞得到的。步骤二所构建的三维培养体系可以反复三维重建。
[0012]优选地，在本发明中，重建后图像分辨率在大于0.1 μ m，而且可以根据需要设定step (每层厚度)，分辨率会更高。按照本发明，经过简单操作和廉价的检测就可以直观观察目的细胞在载体内的分布与数量变化，弥补了普通光学显微镜和荧光显微镜不能很好观察三维培养的细胞的不足。
【附图说明】
[0013]图1.CFDA-SE工作原理示意图CFDA-SE通透细胞膜进入细胞，可以被细胞内的酯酶分解成CFSE，CFSE不可逆地和细胞内蛋白的氨基发生结合反应，并标记这些蛋白，也不会被降解或代谢。
[0014]图2.CFDA-SE染色法观测三维培养细胞的流程图
[0015]图3.三维重建后效果图可见长方体内白色点状即为细胞
【具体实施方式】
[0016]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0017]实施例1
[0018]如图2所示，我们分三步实施本发明方法:
[0019]第一步:细胞染色
[0020]我们选取目的细胞为生长状态良好的第3代脐静脉内皮细胞，2.5%胰酶-0.02%EDTA液消化I分钟，DMEM高糖培养基重悬中和胰酶，4°C下100rpm离心5分钟，PBS重悬制作成浓度为2 X 16的细胞悬液；购自南京恩晶生物科技有限公司5mg的CFDA-SE，用二甲基亚砜溶解成lOmmol/1的储存液，在_20°C冰箱中保存。临用前，取适量储存液用PBS稀释为5 μ M工作液并平衡至室温。将该工作液与脐静脉细胞悬液等体积混匀，37°C避光孵育10分钟，100rpm离心5分钟后弃上清，PBS洗涤3次以去除残余的染色剂，得到着色目的细胞；
[0021]第二步:构建三维培养体系
[0022]我们采取对细胞无毒，溶胀性及降解性良好的载体，载体制作及包封细胞过程为:浓度为I X 14个/ μ I的着色目的细胞与载体等体积混合后，用100 μ I移液器取出30 μ I置入去头端Iml注射器内，缓慢铺于注射器活塞平面上。然后置于37°C温箱内孵育lOmin，待载体呈固态，即构建了三维培养体系，整个过程需要避光；
[0023]第三步:激光共聚焦显微镜三维重建
[0024]三维培养体系加入目的细胞培养基中溶胀lOmin，放入37°C温箱中培养，I天后用激光共聚焦显微镜对其进行断层扫描。利用NIS Elements Viewer 3.20图像采集及处理软件三维重建得到图3效果，其中白色点状结构即为细胞。操作如下:
[0025]I)将三维培养体系取出置入直径35mm的激光共聚焦专用培养皿中，不加入培养基;
[0026]2)设定激光光源488nm波长的绿光，设定绿色通道，点击Acquire菜单下CaptureZ Series里Capture Automatically选项，即为Z轴序列拍摄，在目镜下观察确定需要扫面的顶面和底面并设定，同时设定step，开始扫描。扫描结束后点击“Show Volume Viewer”进行三维重建；
[0027]3)关闭NIS Elements Viewer 3.20图像采集及处理软件和激光共聚焦显微镜，取出三维培养体积置入孔板中继续培养，便于日后对样本重复扫描；
[0028]4)使用激光共聚焦显微镜时，室内避光，远离电磁辐射源，环境清洁，控制工作温度在5?25°C。
[0029]利用CFDA-SE着色后激光共聚焦显微镜重建用于多种三维培养状态的细胞和支架，但是具体染色时间、CFDA-SE浓度和细胞浓度需要自行摸索，以将CFDA-SE对细胞生命活性的影响降到最低。不同时间对同一位置进行扫描和三维重建，必须每次曝光度相同，并对其感兴趣区域统计(ROI Statistics)，还能够分析感兴趣区域面积、平均光强、总光强、
信噪比等信息。
【主权项】
1.一种三维重建观察细胞在载体内增殖分布的方法，包括以下步骤: 步骤一、细胞染色:用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液溶解CFDA-SE，以5微摩尔每升的最终浓度加入到目的细胞悬液中染色，37°C孵育6-15分钟，洗涤去除残余的染色剂后得到着色目的细胞； 步骤二、构建三维培养体系:将着色目的细胞封装在载体水凝胶、蛋白质、基质内构建三维培养体系； 步骤三、激光共聚焦显微镜三维重建:在不同时间点对该三维培养体系不同层面行激光共聚焦显微镜扫描并进行三维重建，得到仅有绿色球形荧光的能直接观察目的细胞在载体内分布的重建图。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述的三维重建是利用NISElements Viewer 3.20图像采集及处理软件进行的三维重建。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤三所得到的重建图的分辨率大于0.1微米。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所得到的重建图是用CFDA-SE染色细胞得到的。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤二所构建的三维培养体系可以反复三维重建。
【专利摘要】本发明提供了一种三维重建观察细胞在载体内增殖分布的方法，该方法过程为：将用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液溶解CFDA-SE，以5uM的终浓度加入到目的细胞悬液中染色，37℃孵育6-15分钟，洗涤后将染色后的细胞封装在载体内构建三维培养体系，在不同时间点对该三维培养体系不同层面行激光共聚焦扫描并三维重建，得到仅有绿色球形荧光的重建图。经过CFDA-SE染色的细胞封装在载体内由激光共聚焦显微镜扫描后三维重建来观察细胞在载体内增殖、分布。该方法简单快捷，仅需10分钟染色，相对荧光标记抗体价格便宜，可以连续观察2个月以上。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104697970
【申请号】CN201510114737
【发明人】张洪跃, 史嘉玮, 赵磊, 董念国
【申请人】华中科技大学同济医学院附属协和医院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月17日