用于哺乳动物细胞中rna干扰的沙门氏菌菌株、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物技术领域，涉及一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌 株、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] RNA干扰技术已经成为沉默特定基因的有效研究工具，同时RNA干扰技术在 癌症等疾病治疗方面也有巨大的应用前景（LiebermanJ等人，TrendsMolMed2003; 9:397-403)。RNA干扰技术可以靶向降解某一特定RNA，调控细胞的增殖和凋亡（Lakka SS等人，0ncogene2004 ;23:4681-4689;GondiCS等人，CancerRes2004 ;64:4069-4077 ; FlemingJB等人，MolCancerRes2005;3:413-423)。但是，如何将RNA干扰片段转运 到细胞的胞浆中等难题阻碍了RNA干扰技术的发展和应用。尽管病毒载体（DevroeE 等人，ExpertOpinBiolTher2004;4:319_327;Kargiotis0 等人，0ncogene2008; 27:4830-4840)、纳米粒子（WangY等人，CurrDrugMetab2010;ll:182-196)和脂质体 (OzpolatB等人，AdvDrugDelivRev2014;66C: 110-116)已用于转运RNA干扰片段，但 是这些转运系统在动物体内都表现出较高的毒副作用，并且会在体内产生靶向并沉默正常 细胞的基因表达的问题。
[0003] 兼性厌氧鼠伤寒沙门氏菌可以靶向聚集在厌氧组织（例如，肿瘤等组织）中 并产生潜在的抑肿瘤等细胞生长效果（ZhaoM等人，ProcNatlAcadSciUSA2007; 104:10170-10174)。作为蛋白质表达质粒载体递送系统，沙门氏菌能够显著抑制了肿 瘤的生长和转移（ZhangL等人，CancerRes2007;67:5859-5864;GanaiS等人，BrJ Cancer2009 ; 101:1683-1691)。但是野生型沙门氏菌表现出较高的毒性。为了降低沙门氏 菌感染动物出现脂多糖诱导的败血症休克的几率，之前的研究人员通过基因改造获得了减 毒沙门氏菌VNP20009,在这一改造过程中，在鼠和猪中诱发毒性的基因purl和msbB被敲 除（LowKB等人，NatBiotechnol1999 ; 17:37-41;ClairmontC等人，JInfectDis2000 ; 181:1996-2002)。这一突变体表现出显著降低的副作用并且在小鼠中的乏氧组织（例如 肿瘤）靶向性，增殖和抑制乏氧组织（如肿瘤）生长现象得以保留（TosoJF等人，JClin 0ncol2002;20:142-152)。作为药物传输系统进行应用时，减毒沙门氏菌VNP20009由于 具备的生物学安全性，自主复制能力和较高的厌氧（如肿瘤）特异性，故而它已被用于表 达外源蛋白（内皮抑素，TRAIL和CCL21)来提高其生物学效果（LoefflerM等人，Cancer Tmmun〇IImmunother2009 ;58:769-775;ChenJ等人，CancerSci2012 ; 103:325-333;Chen J等人，MolCellProteomics2011 ;10:M111009399)。减毒沙门氏菌VNP20009 可以在宿主 细胞中生存和增殖，但由于它在细胞内为细胞内的囊泡所包裹，因此它不能或极少释放干 扰质粒进入宿主细胞的胞浆中，所以减毒沙门氏菌VNP20009并不适合作为shRNA表达质粒 载体，用以沉默哺乳动物细胞中的基因。
[0004] 沙门氏菌ph〇P/ph〇Q操纵子是典型的细菌双组分调控系统，由膜相关传感器激 酶（phoQ)和胞质转录调节因子（phoP)组成（HohmannEL等人，Vaccinel996 ;14:19_24 ;GalanJE等人，MicrobPathogl989;6:433_443)。初步研究显不phoP/phoQ操纵子具有 调控细菌重要毒力的功能，比如细菌在巨噬细胞中的存活水平和对内源性抗菌肽的抵抗 能力（MillerSI等人，ProcNatlAcadSciUSA1989;86:5054-5058;MillerSI等 人，Vaccinel993 ; 11:122-125)。当phoP/phoQ基因位点被敲除后，细菌在巨噬细胞中 的存活率和细菌对BALB/c小鼠的毒性都显著降低（MillerSI等人，JBacteri〇11990; 172:2485-2490;FieldsPI等人，ProcNatlAcadSciUSA1986;83:5189-5193)。 phoP/phoQ敲除的沙门氏菌菌株能够被应用于作为有效的疫苗和shRNA表达质粒传输载 体（HohmannEL等人，JInfectDisl996 ; 173:1408-1414;JiaH等人，CancerImmunol Immunother2012;61:1977-1987;TianY等人，CancerGeneTher2012; 19:393-401;LiX 等人，JCancerResClin0ncol2013;139:971-980)。
[0005] 尽管上述两种沙门氏菌菌株已经具有了较好的生物安全性和较好的作为基因表 达传输载体的性能，但是仍然存在着如下问题：
[0006] 1、phoP/phoQ基因敲除的细菌在巨噬细胞内由于不再被细胞内的囊泡所包裹，因 此细菌的存活率显著降低，从而直接使得PhoP/phoQ基因敲除细菌的应用受到局限。
[0007] 2、phoP/phoQ基因敲除的细菌由于其在巨噬细胞等细胞内的存活能力下降，导致 细菌对BALB/c小鼠等动物的毒性显著降低，但是其仍然对动物具有一定的毒副作用。
[0008] 3、尽管减毒沙门氏菌VNP20009通过基因改造剔除了purl和msbB两个基因而降 低了细菌对动物的毒副作用，但是其对动物仍然具有相当的肝脏、脾脏、免疫等毒副作用 (ChenG等人，CancerScience2009; 100:2437-2443)。
[0009] 4、尽管减毒沙门氏菌VNP20009能够作为基因表达载体的运载工具，但是其不能 作为RNA干扰的运载系统。
[0010] 5、尽管减毒沙门氏菌VNP20009在体内应用时对乏氧组织（例如肿瘤等）具有较 高的靶向性，但是其在脾脏、肝脏等正常组织仍然有一定的分布，从而导致潜在的副作用 (ChenG等人，CancerScience2009; 100:2437-2443)。。
【发明内容】
[0011] 为克服目前沙门氏菌菌株作为RNA干扰传输载体以及在应用时面临的生物安全 性等方面存在的难题，本发明的目的在于提供一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰和基因表 达的沙门氏菌菌株，其制备方法及其在干扰细胞内基因表达或/和同时进行基因表达的应 用、在体内干扰乏氧组织的基因表达或/和同时进行基因表达的应用和制备抗肿瘤药物上 的应用。
[0012] 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0013] -种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，是含有且不仅局限于purl、 msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。
[0014] 优选地，所述沙门氏菌菌株携带表达质粒、在细胞内同时表达RNA干扰和基因表 达。
[0015] 优选地，所述沙门氏菌菌株能够高丰度富集于乏氧组织。
[0016] -种上述的沙门氏菌菌株的制备方法：扩增2个末端含有拟敲除基因同源重组序 列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，转入拟敲除的沙门氏菌中，通过RedA基因重组 系统取代拟敲除基因的编码序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获得突变菌株，经过多轮 重复上述基因敲除过程，最终获得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌 株。
[0017] -种上述的沙门氏菌菌株的制备方法：所述沙门氏菌菌株通过如下方法制得：扩 增2个末端含有拟敲除基因同源重组序列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，将PCR产 物片段克隆在PKD46质粒中，转入拟敲除的沙门氏菌中，通过RedA基因重组系统取代拟敲 除基因的编码序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获得突变菌株，经过多轮重复上述基因 敲除过程，最终获得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。
[0018] 上述的沙门氏菌菌株的制备方法，可直接在purI和msbB基因已经突变的 VNP20009菌株上进行构建突变菌株，也可以在phoP和phoQ已经突变的沙门氏菌菌株上进 行构建突变菌株，也可以在野生型沙门氏菌菌株上进行构建突变菌株。
[0019] -种含有上述沙门氏菌菌株的药物。
[0020] 上述的沙门氏菌菌株在制备抗乏氧组织相关疾病药物中的应用。
[0021] 上述的沙门氏菌菌株在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0022] 上述的沙门氏菌菌株在制备基因治疗药物中的应用。
[0023] 上述的沙门氏菌菌株在制备RNA干扰药物中的应用。
[0024] 上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的药物中的应用。
[0025] 上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗乏氧组织相关 疾病药物中的应用。
[0026] 上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗肿瘤药物中的 应用。
[0027] 上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗乳腺癌药物中 的应用。
[0028] 上述的沙门氏菌菌株在制备抗肿瘤药物与化疗、放疗、生物治疗、中药治疗药物或 方法的联合应用。
[0029] 上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗肿瘤药物与化 疗、放疗、生物治疗、中药治疗药物或方法的联合应用。
[0030] 上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，对动物具有更低的毒 副作用和更高的生物安全性：其在正常小鼠的肝脏和脾脏中的滴度低于VNP20009。
[0031] 上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，在细胞内具有更低的 生存率：其在巨噬细胞和包括肿瘤细胞在内的乏氧细胞中的生存率比VNP20009显著降低。
[0032] 上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，对包括肿瘤在内的乏 氧组织的靶向能力与VNP20009相比显著提高。
[0033] 上述的一种用于哺乳动物细胞中RN