电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法
【专利说明】电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法 本申请是国际申请日为2007年10月17日的国际申请PCT/US2007/022139进入中国、申 请号为200780046652.7的题为"电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法"的发 明专利申请的分案申请。 优先权声明
[00011 本申请要求2006年10月17日申请的临时申请美国序列601852149号和2007年10月 10日申请的美国序列601978982号的优先权。
技术领域
[0002] 除其他内容外，在本发明涉及电穿孔装置和它们在辅助向所选哺乳动物组织优选 皮肤中引入生物分子中的应用。
【背景技术】
[0003] 哺乳动物皮肤或皮肤组织的特点为具有细胞层并分为不同的区域(见图1)。最表 面的区域为表皮（1.1)，其可分为5个亚层：角质层（1.1.1)、棘层（1.1.2)、透明层（1.1.3)、 颗粒层（1.1.4)和基底层（1.1.5)。真皮（1.2)位于表皮之下，是血管化非常丰富的区域;毛 根和汗腺均位于这一层。皮下层位于真皮之下。
[0004] 皮肤已进化至不仅可作为物理屏障也可通过其在免疫系统中的功能发挥保护作 用。作为宿主防御病原体的前线，皮肤有足够的装备进行免疫监督。举例而言，与其他组织 相比，皮肤的表皮包含大量的郎格罕细胞，其为非常强效的未成熟树突状细胞（"DC"）。因 此，将抗原靶向皮肤真皮可有效诱导强免疫应答。但是，表皮（1.1)(见图1)的角质层 (1.1.1)建立的屏障倾向于阻止抗原至表皮的有效进入。树突状细胞是皮肤中的主要抗原 递呈细胞。皮肤中大量种群的DC使真皮内（111杜&(1打111化，"10"）免疫称为具有吸引力的途 径。
[0005] 体内质粒转移技术，尤其是当其涉及转移质粒至真皮内（"ID"）或皮下（"SQ"）组织 或细胞，已传统地受到局限，因为裸露DNA(质粒)转移引起的体内表达水平一直较低，仅有 部分是通过病毒基因转移完成。与可用于肌肉内注射（"頂"）的剂量相比以适用于ID或SQ的 体积给予的质粒剂量较小。许多研究均已表明对向动物和人注射病毒作为DNA载体的安全 性和毒理学的关注(Frederickson等，Mol.Ther. 8:8-10(2003))。因此，直接注射质粒DNA已 成为期望的递送技术，然而，有效传送至细胞和蛋白表达水平是一大难题。骨骼肌细胞提供 了直接质粒转移DNA疫苗和其他应用的主要革E标(Pruc^homme等，Curr.GeneTherAddS-SYSGOOe))。
[0006] 质粒体内递送的最近进展为电穿孔（"EP"）AP可用于递送各种分子:从离子到药 物、染料、示踪剂、抗体和寡聚核苷酸至RNA和DNA(Gehl，ActaPhysiolScand.l77:437-447 (2003))。该方法将目标组织暴露于简单的电场脉冲下，其可诱导在细胞膜中形成瞬时和可 逆的孔。在膜去稳定化过程中，分子例如质粒可进入细胞内。之前，报导已显示对EP方法的 改良可增加转移效率并降低通过使用恒流装置体内产生目标水平抗原所需的质粒量 (Draghia-Akli和Smith，GeneTherapy第245页-TherapeuticMechanismsand Strategies，N.S.Templeton和D.D·Lasic编辑，MarcelDekker，Inc·，NewYork. (2003))。使 用EP增强质粒传送使得被注射组织可用做大量生产和向血流中分泌蛋白质的生物反应器 和/或用于抗原递呈。与单独质粒注射相比表达水平增加了二至三个数量级，增加至可与腺 病毒介导的基因传送可比的水平并且在一些情况下可达到生理学范围。
[0007] 电穿孔已成为基础研究的可用工具，可应用于基因传送和DNA接种领域。已成功使 用电穿孔在注射质粒后转染肿瘤细胞或向人皮肤和皮下肿瘤递送抗肿瘤药物博莱霉素。电 穿孔已用于在小鼠、大鼠、狗和猪中递送编码各种激素、细胞因子、酶或抗原的治疗基因。被 靶向的大量的组织和器官包括肝、眼、睾丸、心肌、平滑肌、不同位置的肿瘤和骨骼肌。
[0008] 大型哺乳动物和人的皮肤EP的一大难题是皮肤厚度的个体差异，以及不同解剖学 区域皮肤厚度的差异。例如，人三角肌皮肤厚度约为2毫米（"mm"），而肩胛水平约2.6mm，腰 部约1.7-1.9mm，大腿为约1.6-1.7mm。皮肤是敏感的，因此也需要调节电极规格(gauge)和 配置(configuration)将不适降至最低。当用于治疗目的时，在治疗中一定程度的不适对于 患者而言有时是可接受的，已建议只有相对无痛的方法可用于预防接种。针对这一难题已 调整电极阵列结构和特性以及装置脉冲模式。已知在电穿孔中从电极尖端约2mm至距其尖 端三分之一电极处的位点可产生最大均一电场。
[0009] Draghia-Akli等的美国专利7245963号描述了模块电极系统和它们在辅助向身体 或植物所选组织的细胞中引入生物分子的应用。模块电极系统包含多个针状电极;皮下针； 可提供程序控制型恒流脉冲控制器与多个针状电极之间传导性连接的电连接器;和一个能 量源。操纵器可抓起这些安装在支撑结构上的针状电极并将它们插入所选身体组织或植 物。接着通过皮下针将生物分子递送至所选组织。程序控制型恒流脉冲控制器被激活并将 恒流电脉冲施加至多个针状电极。所施加的恒流电脉冲辅助将生物分子引入多个电极之间 的组织中。美国专利7245963的完整内容以参考形式并于本文。
[0010]Smith等提交的美国专利出版物2005/0052630描述了可用于有效辅助将生物分子 引入所选身体组织或植物细胞的电穿孔装置。该电穿孔装置包含电动(electro-kinetic) 装置（"EKD"装置），其操作由软件或固件(firmware)设定。EKD装置基于使用者控制和脉冲 参数输入在任何阵列的电极之间产生一系列的程序可控型恒流脉冲模式并允许存储和采 集电流波形数据。该电穿孔装置也包含具有针状电极阵列的可替换电极盘、注射针的中心 注射管道以及可移除的导盘。美国专利出版物2005/0052630的完整内容以参考形式并于本 文。
[0011] 调整美国专利7245963和美国专利出版物2005/0052630描述的电极阵列和方法使 其不仅可以深度刺入组织例如肌肉也可刺入其它组织或器官。由于电极阵列的结构，注射 针（用于递送所选生物分子)也被完全插入目标器官中，并且在电极预描绘的区域内垂直于 目标组织注射。美国专利7245963和美国专利出版物2005/0052630描述的电极优选长20mm 和规格为21。
[0012] 一般而言，电穿孔是使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中的显微可见路径(孔）。这些 孔通常称作"电孔"。它们的存在使得生物分子、离子和水从膜的一边通过至另一边。因此， 电穿孔已被用于向多细胞组织引入药物、DNA或其他分子并证明对于某些疾病的治疗是有 效的。然而，在活体内使用EP存在若干问题，包括所产生的热量和电孔不能重新闭合引起的 细胞死亡。在发生过量细胞加热和细胞死亡的EP方法中药物或生物分子的有效作用非常有 限。
[0013] 为了更好地理解电穿孔过程，需要了解一些简单的方程式。当在植入组织中的电 极施加电势差（电压）时，它会产生电场（"E"），其为施加电压（"V"）除以电极之间的距离 ("d"）。 E=V/d
[0014] 当设计电穿孔方案用于递送药物或生物分子至受试者细胞时电场强度E是一个非 常重要的数值。在给定电压下电场强度与电极间距离成反比，当电极间距离减小时电场强 度增加。但是，值得注意的是可在具有绝缘电极的组织中产生电场（即离子的流动不一定产 生电场）。虽然不愿意受到理论的束缚，人们认为离子流打开了电孔并使得在电穿孔过程中 分子运动至受试者细胞内。在导体中和具有电势差的两点之间的介质中电荷的流动称作电 流。电极间的电流由组织中的离子或带电颗粒实现，其在组织和患者之间存在差异。而且， 组织中导电离子的流动可从电脉冲开始至电脉冲结束在电极之间变化。
[0015] 当组织具有小比例的导电离子时电阻增加，产生热量并杀死细胞。欧姆(〇Ws)定 律表达了电流（"I"）、电压（"V"）和电阻（"R"）之间的关系： R=V/I
[0016] 两个电极之间组织中的电阻随着其中存在的带电颗粒而变化。因此，组织中的电 阻从电脉冲开始至电脉冲结束发生变化。
[0017] 加热是电极间阻抗的乘积（即电阻与电抗的组合并以欧姆测量)并与电流乘积、电 压和脉冲时间成正比。加热也可表示为电流的平方和脉冲时间（"t"，时间）。例如，在电穿孔 中，支持组织中产生的加热或功率（"W"，瓦)可由下列等式表示： ff=I2Rt
[0018] -般而言，将金属或电解质电极与组织接触并在电极上施加预定电压的短脉冲使 细胞开始瞬时开放膜孔。目前描述的电穿孔方案就所得电场强度E定义，其取决于与电极间 距离成正比的电压的短脉冲并与电流或组织电阻无关。因此，无法测定被电穿孔组织的阻 力或加热，这导致不同脉冲电压电穿孔方案各种各样的(varied)成功。确定的是，可辅助有 效电穿孔的电穿孔方案和引起细胞死亡的电穿孔方案之间的电压脉冲的上限振幅差异是 很小的。此外，已观察到由短电压脉冲的上限振幅引起的细胞死亡和加热之间的确定联系。 因此电极间细胞的过度加热成为任何给定电穿孔电压脉冲方案无效的主要原因。此外，电 极间电流而不是电极间的电压成为任何给定脉冲方案有效性的主要决定因素。
[0019] 当电流递送至受试者细胞时，电流的剂量可根据下式由电荷（"Q"）精确描述，其为 电流（"I"）和时间 Q=It
[0020] 如果电流不是恒定的，Q表示I的时间积分。在这一方面，带电颗粒，无论是离子或 分子，具有相似的行为方式。举例而言，当将银离子沉积在电极上以定义电荷的标准单位 (库伦)时，只有电荷(如上所定义)是重要的。必须存在某一最小电压以产生电流，但不能从 预测定电压测定沉积离子的量。相应地，递送至电穿孔器中细胞的带电颗粒的量也不能衍 生自施加于电极的电压。
[0021] 电穿孔的有效性受限于这一事实:脉冲强度存在阈值和上限，阈值之下不发生电 穿孔而高于上限会破坏细胞。实验数据显示上限和下限之间的差异很小以致于很难设计有 效的脉冲方案而不存在不适当的实验。这使得该技术使用困难，主要是当目标组织天然具 有非均一的细胞组分时，例如不同厚度的表皮和真皮中的皮肤细胞以及层(strata)、脂肪、 筋膜（fascia)的数量，不同大小的血管从毛细血管至小血管；只有可以即时 (instantaneously)分析个体与个体之间以及个体皮肤表面位点之间的即时条件变化的精 确（true)软件驱动装置可以满足这些要求。而且，电极应该适应皮肤形态学并防止皮肤损 伤和出血。
[0022]针对电穿孔装置的参考文献例证了电极装置和体内电穿孔方法的可用性。相应地 有很多美国专利主张特异电极或电穿孔方法。例如，Zhang，等人的美国专利6302874描述了 电辅助局部递送用于美容应用的试剂的方法。Hofman等人的美国专利5676646教导了经电 穿孔装置的流动将分子植入患者的活血细胞中。Hofman等人的美国专利6241701和6233482 描述了电穿孔介导的递送药物和基因的方法和装置。更具体而言，他们描述了用电穿孔和 化疗剂组合治疗肿瘤以产生体内肿瘤退化的电穿孔疗法（"EPT"）的方法和装置。Hofman等 人的美国专利6216034描述了编程用于组织电穿孔疗法的针状电极阵列的程序化方法。 Hofman等人的美国专利6208893描述了具有连接电极模板的电穿孔装置。Hofman等人的美 国专利6192270描述了装置的电极组件和跨表面分子递送的方法。Hofman等人的美国专利 6181964描述了最小侵入性装置和电穿孔递送药物和基因至组织的方法。Nanda等人的美国 专利6150148描述了根据使用者特定脉冲和温度曲线方案通过产生和应用电场以控制过程 中的温度的电穿孔装置。Hofman等人的美国专利6120493描述了使用电场电穿孔装置引入 治疗药剂的方法。Hofman等人的美国专利6096020描述了根据使用者特定脉冲方案以产生 和施加电场的电穿孔方法和装置。Hofman等人的美国专利6068650描述了用于体内电穿孔 疗法的选择性应用针阵列结构的方法以及Hofman等人的美国专利5702359描述了应用电穿 孔至患者身体的一部分并具有感应元件感应电极间距离并产生与所述电极之间的距离成 正比的距离信号的电极装置，以及对所述距离信号具有响应性用于应用高振幅电信号脉冲 至与所述电极间距离成比例的电极的方法。Mathiesen等人的美国专利出版物2005/ 0070841公开了电穿孔装置和注射装置。所有这些引用专利均以参考形式并于本文。与本文 所示新颖皮肤电极组合使用并用于本文所述实验中的装置主张于美国专利出版物2004/ 0167458和美国专利出版物2005/0052630，其各自的完整内容以参考形式并于本文。
[0023] 最近报导了通过使用电穿孔增强体内质粒表达以及分泌型蛋白所达到生理学水 平的进展（Draghia-Akli等，TechnologyinCancerResearch&Treatment1:365-371 (2002)。研究显示注射表达生长激素释放激素（"GHRH"）的质粒然后电穿孔是可扩展的并且 代表了用于稳定生产治疗大型哺乳动物的分泌蛋白的方法(Draghia-Akli等，Journalof AnimalScience81:2301-2310(2003);Draghia-Akli等，FASEBJ17526-528(2003))。仍 然需要电穿孔技术的其他改进，尤其是用于接种目的和基因治疗的有效皮肤电穿孔以及侵 入性和疼痛降低的电穿孔。
[0024]之前的研究者已使用电穿孔装置用于质粒DNA转移，其概念性的基于恒定电压系 统，使用电极间的预设定电压。因为包埋在组织中的电极之间的阻抗在不同情况下和不同 组织中存在差异，预设定电压不能产生预定电流。除了丧失完美的方波功能，预定电压脉冲 引起在脉冲持续中流经肌肉组织的电流未经调节的增长。相反，恒流电源事实上可以维持 流经肌肉组织的方波功能恒定电流。但是，现有的市售电穿孔装置不具有经设计可测定细 胞所暴露的精确电流量的固件。传统电穿孔装置产生的未调节电流可能在在组织中生成很 容易杀死细胞的大量热量。例如，流经典型的25欧姆（"Ω"）负载阻抗的平均电流为5安培 ("A"或"Amp"）的典型的50毫秒(ms)电脉冲理论上可将组织温度升高7.5°C，这足以杀死细 胞。Lee等人综述了电休克引起的组织损伤物理学（Lee等，Annu·Rev·Biomed.Eng2:477-509. :477-509(2000))。因此，需要通过提供有效控制递送至细胞的电量避免与恒定电压电 穿孔相关的技术问题并藉此达到熟练的电穿孔同时限制对细胞的破坏。
[0025] 许多电极存在的问题根源于这一事实:脉冲能量浓缩在阵列中央，即放置被转染 材料的位点。结果，能量传送的空间分布具有非常不均一的特性。因此，只有电极组件所包 容体积中的一部分细胞被电穿孔。因此也需要一些应用以通过精确控制与细胞膜中的管道 碰撞的离子流提供有效控制递送至电极间空间的细胞的电流量的方法。而且，用于大型动 物应用和人类的现有市售电极都不允许ID或SQ靶向树突状细胞，因为它们通常太长并且具 有不适当的规格和不适宜的斜面方向。因此，需要皮肤电穿孔仪的某些应用，可以辅助内体 递送生物分子(例如质粒)至皮肤组织，例如动物的ID或SQ空间。
[0026] 此外，可商业购买的电穿孔装置和针阵列不允许控制组织电阻、厚度和局部条件 的个体间和个体内差异。使用这些仪器，将预设定电压递送至电极，不考虑个体的组织电阻 或厚度。因此，需要允许能考虑到脉冲之前或过程中个体差异的适应性电穿孔的电穿孔装 置和皮肤电极。
[0027] 此外，使用皮肤和肌肉侵入性可替换针阵列作为电极递送电流的电穿孔装置在发 生针阵列替换时需要维持无菌条件。这从医疗实践和调控顺应性角度而言都是必要的。同 时，需要一次性(disposable)皮肤电极以允许更低的生产成本和在治疗和预防目的的大规 模接种中使用。因此，需要提供允许简易替换针皮肤阵列(need1eskinarray)的皮肤电极 盘。
【发明内容】
[0028] 在本发明的一方面提供了通过向组织递送恒定电流对哺乳动物组织进行电穿孔 的电穿孔装置，其中该组织优选皮肤组织。在一些实施方案中，将电穿孔装置配置成可以向 期望的哺乳动物组织递送能量脉冲并产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流。电 穿孔装置包含电穿孔组件和皮肤电极组件。电穿孔组件可递送在期望组织中产生恒定电流 的能量脉冲并包括反馈机制。皮肤电极组件包括在空间排布中具有多个皮肤电极的电极阵 列，其中所述皮肤电极组件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其通过皮肤电极递送至期 望组织。在能量脉冲传送中多个皮肤电极的至少一个为中性(neutral)并测定期望组织中 的阻抗并将该阻抗传递至电穿孔组件。反馈机制可接受已测定的阻抗并可调节由电穿孔组 件递送的能量脉冲以维持恒流。
[0029] 在本发明的一方面提供了经配置向期望哺乳动物组织递送能量脉冲以在期望组 织产生与使用者输入的预设定电流相似的电穿孔手柄组件。该手柄组件包含在空间排布中 具有多个皮肤电极的电极阵列，其中所述皮肤电极组件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并 将其通过皮肤电极递送至期望组织。与皮肤电极阵列联通的控制器。该控制器可控制经皮 肤电极的能量脉冲的传送；以及实施反馈机制的方法，其中通过软件或硬件实施反馈机制， 其接受来自中性皮肤电极的已测定阻抗并按需要调节所递送的能量脉冲以维持恒定电流。
[0030]在本发明的一个方面提供了使用本发明的电穿孔装置向哺乳动物的组织细胞递 送生物分子的方法。在一些实施方案中，该方法包括使用本文描述的皮肤电穿孔装置向期 望皮肤组织递送能量脉冲以产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流。该类方法包 括:将多个针状皮肤电极插入皮肤组织中而基本不刺入肌肉组织;将能量脉冲施加至多个 针状皮肤电极以递送与皮肤组织中预设定电流相同的电流;用多个针状皮肤电极中的一个 中性电极测量阻抗并使用电穿孔装置中的反馈机制响应已测阻抗调节施加的能量脉冲以 维持递送至皮肤组织的电流恒定。
[0031]在本发明的一些实施方案中提供了包含以下步骤的方法:提供具有多个针状皮肤 电极的皮肤电极组件;与电流波形发生器电连接的皮肤电极组件;将哺乳动物皮肤与多个 针状皮肤电极接触而基本上不刺入哺乳动物的肌肉组织;将电流波形发生器的电能量脉冲 施加至多个针状皮肤电极一段时间并在可将所接触皮肤组织有效暴露在基本恒定电流的 条件下进行。
【附图说明】
[0032]通过参考附图本领域技术人员可更好地理解本发明的多个目标和优点。
[0033]图1显示了皮肤结构示意图。最表面的区域为表皮（1.1)，其可进一步分为5层：角 质层（1.1.1)、棘层（1.1.2)、透明层（1.1.3)、颗粒层（1.1.4)和基底层（1.1.5)。真皮（1.2) 位于表皮之下，是血管