它们可适用于皮肤EP装置中或作为其一部分。本文以该 元件的硬件功能描述各元件。这些出版物的完整内容以参考形式并于本文。由硬件启用的 事件序列由软件或固件或二者的组合控制，如本文所述。
[0111] 在一些实施方案中，皮肤EP装置的电穿孔组件包括电极-连接继电器(relay)矩 阵，其可辅助程序化序列并可操作皮肤电极组件中电极的点火。继电器矩阵可控制各电极， 优选针状电极，这样各电极处于五种状态之一:关闭、正极低电压、阻抗测量输入、正极高电 压和负极(调控)高电压。在一个实施方案中，继电器矩阵包括11个双极、可产生切换矩阵的 双掷(DTOT)继电器。这些继电器中的10个由一组与串行外设接口（SPI)端口连接作为SPI至 并行端口的移位寄存器驱动。SPI从入主出（SM0)与两个74VHC595(或经认可的等同芯片） 的移位寄存器的数据输入引脚连接。74VHC595具有两个时钟输入。通用串行同步/异步通信 接口时钟(UCLK)信号与用于转移数据至寄存器的寄存器移位寄存器时钟输入(SCK)引脚连 接。单独的通用输入输出(GPIO)引脚通向存储寄存器时钟(RCK)的时钟输入，用于将移位寄 存器数据并行时钟(clock)至输出寄存器。结果是相同的串行数据移动(shifted)到两个移 位寄存器中，但随后数据仅被时钟(clockedinto)到待变的输出寄存器中。
[0112] 为了驱动实际的继电器线圈，SPI端口回路的输出（feed)2个ULN2003A(或经认可 的同等物)8信道继电器线圈驱动器。该芯片主要为集电极开路双极结晶体管(BJTs)阵列。 各信道输出也具有横跨的内部回程二极管-不需要外部二极管。继电器线圈的正极面限制 在15伏，线圈的阴极面经ULN2003A部件接地。
[0113] 接触矩阵中有3组继电器。继电器接触矩阵的实例可见图26。第一组实际上为1 DPDT继电器。一组接触将正极电压从低电压即阻抗测量电压转换200V供给的输出。相同继 电器中的另一组接触转换阻抗测量回路和脉冲电流控制回路之间的负极电压。因此，该继 电器的位置设定正极和负极电压二者以形成电脉冲或进行阻抗测量。下一组继电器为极性 继电器的5继电器组。这些继电器(每个电极一个)转换该电极的极性至正极或负极电压。最 后一组继电器为线内组接触以允许各接触相互分离为正极或负极。为了延长继电器接触的 寿命，该矩阵仅用于以期望方式将荷载连接至适当的电极上。接着脉冲或阻抗回路通过电 压或电流至荷载。然后在打开接触之前移除电压或电流。由于施加电流时接触事实上不会 转换，因此可大大延长接触的寿命。
[0114] 由皮肤EP装置产生的电脉冲的实例显示于图3.1和3.2。图3.1和3.2显示了各电脉 冲的波形。波形参数为： 周期（tp):l〇〇〇ms±250ys. 上升时间（tr):最大值20ys置位（settling)时间（ts):最大值20ys 脉冲宽度(tw) :52ms± 100ys 衰减(fall)时间（tf):最大值20ys 额定电流（11〇:111三（〇.1八，0.2八，0.3八...1.5八）±10%乜过程中的1 11并且1?1<10(^。1?1 为图3.3和3.4显示的任一 3电极组合之间的负载电阻。图3.1和3.2中仅限定了电流波形。电 压波形的形状取决于电脉冲点火时电极的阻抗(th过程中hth过程中没有限定电压波形因 为在这一阶段阻抗是未知的。th过程中经过任何电极组的电压为0V。
[0115] 尽管不希望受到理论的束缚，据信电穿孔利用相同的结构并迫使高离子流经过这 些结构，打开和扩大导管。金属或电解质电极与组织接触并且向它们施加与电极间距离成 正比的预设定电压。用于电穿孔的方案就其所得电场强度定义，根据式E=V/d，其中（?"为 电场。（"V"）为施加电压，（"d"）为电极间的距离）。
[0116] 当形成用于递送药物或生物分子至受试者细胞的电穿孔方案时电场强度E具有重 要价值。因此，可以通过时间与电极间距离成正比的预设定电压脉冲计算各种方案的电场 强度。但是，值得注意的是可在具有绝缘电极的组织中产生电场(即离子流动不一定产生电 场）。尽管不希望受到理论的束缚，电流对成功EP是必要的，而不是电场本身。皮肤EP装置的 电流波形发生器的活化将恒定电流电脉冲分布至多个针状皮肤电极这样分散EP事件发生 在不产生一致EP重叠点的区域。分散EP区域细胞的通透性增加并且生物分子被递送至受试 者细胞中而不会过度加热和损害细胞或组织。
[0117] 本发明一方面涉及向动物的一个或多个细胞尤其是皮肤中引入生物分子的皮肤 EP装置，用于ID或SQ接种目的。优选地，该皮肤EP装置向皮肤组织例如ID或SQ组织中引入生 物分子，其方式为在整个电脉冲传送过程中在相同的组织中递送和维持恒定电流。在一些 实施方案中，皮肤电极手柄组件的手柄为非传导性的并经设计向使用者提供向所选组织尤 其是皮肤组织植入针状皮肤电极组件的简便方法。使用在手柄上具有搭锁式固定装置 (snap-onmounts)的一次性针状皮肤电极盘使得使用者可以快速连接和分离针状皮肤电 极盘并允许在接受治疗的受试者之间的快速(并且无菌)转换。皮肤EP装置的电源可使用在 电源插座和其他电源的获得和使用是危险的或不方便的情况下(例如在生物恐怖袭击中的 大规模接种)使用的电池组。
[0118] 递送至皮肤组织细胞例如SQ和ID组织中的生物分子包括DNA质粒、DNA疫苗(DNA质 粒和DNA疫苗不互相排斥）、基因、治疗药物或其他试剂，不论是补充剂或增强剂。优选地，该 生物分子为可在目标皮肤组织细胞中表达的DNA质粒，用于皮肤EP递送的生物分子可包括 多于一种生物分子。在一些实施方案中，该生物分子为DNA质粒。
[0119] 与本发明一起使用的DNA质粒可用于基因疗法中，即将所选基因递送至宿主用以 预防、缓解或治疗损伤或疾病状态。使用皮肤EP装置DNA质粒可在哺乳动物中表达相关基因 以缓解疾病症状，降低疾病的致病性、消除疾病的根本诱因或预防疾病的发生。DNA质粒中 的编码基因可为获自外源性来源的外源基因。基因疗法可用于基因相关疾病，例如囊性纤 维化或肌肉萎缩症。基因疗法也可用于肿瘤的治疗。优选地，DNA质粒的基因编码释放生长 激素的激素或胰岛素生长因子I，无论是合成或天然形式或其全长或功能片段。
[0120] 在一些实施方案中，与本发明一起使用的DNA质粒可引入哺乳动物细胞用于接种 目的或接种抵抗感染性疾病，例如肝炎、流感、登革热、日本脑炎和HIV。在一些实例中DNA质 粒可表达病毒蛋白免疫原性片段的多肽。
[0121] 可作为生物分子通过皮肤EP递送至皮肤组织的药物的实例包括具有抗肿瘤或细 胞毒性作用的化疗药物，包括博来霉素、新制癌菌素、苏拉灭、多柔比星、卡铂、紫杉醇、丝裂 霉素C和顺铂。其它化疗药物为本领域技术人员已知并可在包括默克索引的参考文献中找 至IJ。此外，有助于跨膜递送的试剂（"递送剂"）也可作为生物分子考虑进行递送并包括:N-烷 基醇酰胺和对氯苯甲酸汞。在生物分子为DNA质粒或DNA疫苗的实施方案中，与DNA质粒或 DNA疫苗同时递送，在其之前或之后递送的另一生物分子可为附加的一个或多个DNA质粒或 DNA疫苗。在其中的生物分子为预期表达诱导免疫应答的靶蛋白的DNA质粒或DNA疫苗的实 施方案中，与DNA质粒或DNA疫苗同时、在其之前或之后递送的另一生物分子可为进一步增 强对该靶蛋白的免疫应答的一个或多个蛋白的基因。该类基因的实例为编码其它细胞因子 和淋巴因子者，例如α干扰素、γ干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFa、TNFP、GM-CSF、内皮生长因子（EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、 ⑶86和IL-15,包括信号序列缺失的IL-5并任选包括来自IgE的信号肽。可使用的其他基因 包括编码以下者:MCP-1、MIP-1、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋 S、CD34、GlyCM-l、MadCAM-l、LFA-l、VLA-l、Mac-l、pl50.95、PECAM、ICAM-l、ICM-2、ICAM-3、〇02、^^-3、]?-05?、6-05?、11^-4、11^-18的突变形式丄040、〇)401^血管生长因子、11^-7、神 经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Ap〇-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Ap〇-3、 AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、CaspaseICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap-l、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、InactiveNIK、SAP1(、5八卩-1、了疆、干扰素 应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、 TAP2及其功能片段。
[0122] 普通技术人员理解可对皮肤EP装置进行很多改变和修改而不偏离本发明精神和 范畴。皮肤EP装置可包括任何数量的电极例如不同形式的三电极阵列，其可参见图11.选择 距离L这样点B的能量强度是点A的三分之一。三次脉冲之后（1至2,2至3,3至1)，点B接受了 与点A相等的累积剂量。由于阵列中电极数量增加，产生均一能量分布所必须的距离L也成 比例增长。L=kXn，其中η为电极数量，k为比例常数。因此，通过选择更大数量的电极可包 围更大体积的组织。皮肤电极最佳数量的选择取决于被转染材料的体积和其在注射和电穿 孔之间分散的远近。 实施例
[0123] 进一步在以下实施例中例证本发明。应理解的是虽然实施例指明了本发明的优选 实施方案但是仅用于说明目的。从上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明 的基本特点并对本发明进行各种改变和修改以适应各种应用和条件而不偏离其精神和范 畴。因此，除本文所显示和描述者之外的本发明各种修改对于本领域技术人员是显而易见 的。这些修改也应属于附属权利要求的范畴。
[0124] 优选地，与本文所述皮肤EP装置一起使用的DNA制剂应具有高DNA浓度，优选最佳 用于递送至皮肤的小体积内包括毫克量DNA的浓度，优选小注射体积，理想为25-200微升(μ L)。在一些实施方案中，该DNA制剂具有高DNA浓度。例如lmg/mL或更高(mgDNA/制剂体积）。 更优选地，DNA制剂具有可在200yL制剂中提供克量DNA的浓度并且更优选在100yL制剂中提 供克量DNA。
[0125] 与本发明皮肤EP装置一起使用的DNA质粒可使用已知装置和技术的组合配制或生 产，但是优选使用描述于共同拥有的未决美国临时申请美国序列60/939792号（2007年5月 23日申请）的经优化的质粒生产技术生产。在一些实施例中，可以大于或等于10mg/mL的浓 度配制用于这些研究中的DNA质粒。这些生产技术也包括或并入本领域技术人员熟知的各 种装置和方案，除美国序列60/939792号所描述之外还包括共同拥有的美国专利7238522号 (2007年7月3日颁布)所描述者。与本发明皮肤EP装置和递送技术一起使用的高浓度质粒可 以适当的低容量给予质粒至ID/SC空间并辅助增强表达和免疫作用。共同拥有申请和专利 即美国序列60/939792号和美国专利7238522号均以其完整内容并于本文。 实施例1皮肤电穿孔电动装置（"皮肤EP装置"）的操作
[0126] 首先将皮肤EP装置的电源打开。固件维持空闲状态直至接收到使用者的输入。为 了起始电穿孔顺序，输入密码在LCD上获得介绍性提示以起始电穿孔序列。这时，按压手柄 组件活化器开关。接着使用者输入数字，优选受试者识别号码，其与各次脉冲一起被记录并 保存用于之后的下载。优选使用数字键盘输入号码。然后以适当的小注射体积以ID或SQ注 射给予生物分子制剂，理想为25-200皮肤升（skinliters)并且将皮肤电极阵列插入皮肤 以完全包围轻易可见的注射面积。接着使用者在蜂鸣器"蜂鸣声(beep)"的提示下按压活化 器开关以继续电穿孔序列。当按压活化器开关之后，固件确立阻抗检测器是否被启用。如果 阻抗检测器被启用，软件立即执行一系列的阻抗测定。固件检测低DC电压电极之间的阻抗。
[0127] 将电极插入目标组织后并且在阻抗检查阶段，处理器在电极水平检查组织的传导 性。这样做以确保电极与患者的目标组织发生了电子接触。这些测定在数秒左右内进行并 具有足够时间完成准确读数，通常小于2秒。在阻抗检测过程中，手柄组件上的红色LED发 光。如果任何阻抗测定失败，表示错误的长蜂鸣声响起，手柄LED仍为红色，LCD将显示错误 并且固件返回至空闲状态。
[0128] 如果所有的测量均通过，发出短蜂鸣声，手柄上绿色LED发光并且该显示提示使用 者按压活化器开关以继续。固件等待再次按压手柄活化器开关以继续顺序。如果这时按压 了键盘上的任何键，将响起错误长蜂鸣并且该单元将返回空闲状态。
[0129] 固件按照所选脉冲程序设定执行点火序列。在各电脉冲或能量脉冲的递送过程 中，EP装置根据目标组织(例如皮肤）中的所测电阻持续调节其输出以维持预期电流。实质 上，处理器通过将预期输出电流水平设置至使用者输入的预设定电流值以起始脉冲。由于 目标组织电阻变化硬件反馈环(例如类比闭环回路)通过调节在电极间施加的电压持续维 持预期输入电流。在能量脉冲的递送过程中，处理器记录脉冲波形。当通过此时设定预期输 入电流至零满足脉冲时间长度时处理器终止脉冲。当脉冲序列结束，处理器复查波形数据 并当电穿孔序列过程中电流不在设定参数之内时提醒操作者;藉此告知使用者电穿孔序列 或处理是否错误。
[0130]当成功完成EP序列时，皮肤EP装置回复至空闲状态。在完成电脉冲序列之后IXD上 会进一步可视确认成功生成电场。每次序列之后，LCD将显示一列三或五个数字，其为"0"或 "Γ，各数字表述电穿孔序列的各次脉冲。"〇"指示脉冲正常而"Γ指示脉冲不正常。更具体 而言，各次脉冲必须达到设定电流的至少90%才称之为正常或在LCD上显示"0"。如果某一 脉冲达到小于设定电流的90%，该脉冲为不正常并且显示"1"。而且，显示不正常脉冲的最 低和平均电流。例如，对于设定于0.5安培电流的五次脉冲电穿孔序列，如果脉冲3和5分别 仅达到0.4安培和0.3安培，将显示"00101"以及"低:60 %平均80 %"。当递送治疗或预防应 用的疫苗时这一控制机制是必须的。如果疫苗递送不足，很有可能达不到治疗或保护需要 的抗体或细胞应答并且受试者可能生病(Roth等，2005)。 实施例2数据采集和存储
[0131]皮肤EP装置软件或硬件可实现实时数据采集并存储至非易失性存储器中。图2C显 示了在电穿孔过程中采集的第一部分数据。文件标题的第一部分包含文件名称（"2.Γ)和 动物编号（"2.2"）。分栏(columnar)数据（"2.3"）描述了脉冲序列，脉冲前的等待时间，脉冲 宽度和三个电极各自的脉冲电流。图2.4显示了数据的第二部分，其鉴定在给定脉冲序列中 各电极的结构。图2.5显示了相同电穿孔的原始数据第三部分的格式化版本。该文件以 MicrosoftExcelCSV文件下载自皮肤EP装置。拷贝数据并粘贴至模板MicrosoftExcel Spreadsheet文件。Spreassheet的列显示电脉冲过程中测定的电压(V)和电流(Amps)以及 计算的组织电阻(Ohms)。将较小电极用于猪皮肤之后下载的数据比使用较大电极(700 Ω至 2200 Ω)之后得到的皮肤电阻几乎增加一倍。 实施例3质粒设计、递送方法以及在猪中的实验性研究 [0132]质粒构建。用于本文所述实验中的pEGFP-Nl编码野生型GFP的红移变异体，其经优 化具有更亮的荧光和在哺乳动物细胞中更高的表达(最大激发光= 488nm;最大发射光= 507nm)iGFP-Nl编码包含Phe-64至Leu和Ser-65至Thr两个氨基酸替换的GFPmutlJGFP基 因的编码序列包含多于190个沉默碱基变化，其与人密码子使用偏好一致。侧接EGFP的序列 被转化成Kozak-致序列翻译起始位点以进一步增加在真核生物细胞中的翻译效率。EGFP 基因下游的SV40多腺苷酸化信号指导EGFPmRNA3'端的适当加工。载体骨架也包含用于在 哺乳动物细胞中复制的SV40复制起点并表达SV40T抗原。新霉素耐药盒(neor，由SV40早期 启动子、Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因和疱疹单纯胸苷激酶基因的多腺苷酸化信号组 成)使得可使用G418筛选稳定转化的真核生物细胞。这一盒上游的细菌启动子在大肠杆菌 中表达卡那霉素抗性。pEGFP-ΝΙ骨架也提供在大肠杆菌中增殖的pUC19复制起点和用于单 链DNA生产的Π起点。
[0133] 电穿孔条件。在所有实验中使用方波脉冲。单独说明各实验的电穿孔条件。在所有 情况下，恒定电流为0.1-0.4Amps，具有2或3个脉冲并持续20或52毫秒/脉冲，脉冲之间相隔 一秒。控制皮肤EP装置电穿孔装置(之前用于向骨骼肌递送生物分子)包含5个等空间分布 的规格21固体不锈钢针状电极的环形阵列(直径lcm)，安装于非传导性材料上。皮肤电穿孔 皮肤电极由以等腰三角形排列的三个规格26固体不锈钢针状电极组成(两个长边长5mm，短 边长3mm)，安装于非传导性材料上。
[0134] 将质粒DNA肌肉内注射至猪。在GFP实验中使用三至六周大，重量在15-40公斤的混 合性别的幼杂种猪。在可随意获取食物和水分的单独围栏中饲养动物。在无菌水中稀释不 含外毒素的质粒制剂并用经HPLC纯化的低分子量多聚L谷氨酸(平均MW10900)配制成1%重 量/重量。在实验的第0天，手工控制动物并如所述直接ID/或SQ注射GFP质粒溶液。在一个方 格的距左上角中心2cm处划下标记，其中注射位点在该方格的中间，这样可容易地识别和剖 割各注射位点。当发现适当的注射位点时应避免所有主要的表面血管。
[0135] 皮肤收集。将猪放血并识别注射位点。立即在各注射位点剖割2.5cm方形面积的皮 肤、皮下组织和少量下层的肌肉。使用紫外光于365nm波长在暗室中观察剖割区域。
[0136] 表达区域的照相分析。使用数码相机给显示足够荧光的样品照相。对没有或荧光 量很少的样品不进行照相。由三名不了解该处理的观察者对荧光在0-5范围内评分。0分评 给无荧光者，1分评给经观察具有少量荧光并没有被照相者，3-5分评价自被照相的荧光。保 存样品用于组织学检查。 实施例4对照研究
[0137] 将所有检测条件的数据制表。图10仅表示平均分高于或等于2的条件，而最大可能 评分为5(对评分的解释可参见段落[0099])。如数据所示，使用皮肤特异性皮肤阵列（图10， 第一行)达到了最好的整体结果。虽然下一组（图10,第二行)具有相同的分数，但是应注意 皮肤阵列（"MA"）仅使用配置于50yL中的50yg质粒，而大阵列（"LA"）使用两倍的量即配置于 100yL中的lOOyg质粒。此外，对皮肤电极阵列使用经优化的条件显著降低了操作