化非常丰富的区域；毛根和汗腺均位于这一层。皮下层位于真皮之 下。
[0034]图2A显示了本文所述EP装置优选实施方案的图解。
[0035]图2B显示了可为本文所述EP装置一部分的控制器的实例。
[0036]图2C显示了在脉冲序列末端下载的实际脉冲序列记录，使用皮肤EP作为脉冲发生 器并且使用所述皮肤电极阵列在质粒制剂注射至25kg猪的ID和SQ皮肤层之后递送电脉冲； ("2.Γ)显示通过红外线端口下载至个人电脑上或便携装置上的文件名；（"2.2"）显示了受 试者数量，通过数字键盘直接输入皮肤EP装置，作为EP过程可以开始之前的前提条件； ("2.3"）显示了操作人员选择的电脉冲特性，包括脉冲序列中的脉冲数量，脉冲之前和之间 的等待时间（以秒计算，"s"），脉冲宽度（以毫秒计，"ms"），脉冲电流振幅（以安培计，"A"）； ("2.4"）显示了在各次脉冲中各电极的电荷-对于各皮肤电极1、2、3任何下列位置都是可能 的："正极"，"pos" ；负极，"neg" ；或关闭关闭"电极在各次脉冲之前、过程中和之后 向装置输入信息（"反馈"（"2.5"）显示了在脉冲序列的各次脉冲中的实际安培（"A"）、电 压（"V"）和注射区域的皮肤电阻，Z( "欧姆"由于每0.1-0.2ms(并且这种情况下脉冲长度 为52ms)产生反馈，所以为了举例目的仅包括了一小部分反馈文件。
[0037]图3显示了通过皮肤EP装置使用皮肤电极递送电脉冲时所下载数据的图解显示实 例。该图描述了脉冲1( "3.1"）中皮肤EP装置测定的电压（"3.1.1"）和电流（"3.1.2"）以及脉 冲2( "3.2"）中通过皮肤EP装置测定的电压（"3.2.1"）和电流（"3.2.2"）。也显示了脉冲1 ("3.Γ)和脉冲2( "3.2"）的组织电阻(在电脉冲过程中测定）。
[0038]图4显示了通过皮肤EP装置使用大电极阵列向皮肤递送电脉冲时所下载数据的图 解显示实例。该图描述了脉冲1( "4.1"）中皮肤EP装置测定的电压（"4.1.1"）和电流 ("4.1.2"），脉冲2( "4.2"）中通过皮肤EP装置测定的电压（"4.2.1"）和电流（"4.2.2"）以及 脉冲3( "4.3"）中通过皮肤EP装置测定的电压（"4.3.1"）和电流（"4.3.2"）。也显示了脉冲1 ("4.Γ)、脉冲2 ( "4.2"）和脉冲3 ( "4.3"）的组织电阻(在电脉冲过程中测定）。
[0039] 图5显示了皮肤电极阵列的图解表示，包括详细的特性：（"5.1"）侧视图描述了单 个针状电极的长度和插入末端的角度；（"5.2"）前视图描述了反套针点（revere-trOChar point)的角度和程度；（"5.3"）表明了针状电极的规格。
[0040] 图6显示了皮肤电极手柄的视觉展示（"6.Γ)和图解：（"6.1.Γ)用于活化阻抗检 查和电穿孔序列的触发器；（"6.1.2"）当皮肤EP装置准备治疗或出现错误时"LED"分别显示 绿色或红色。（"6.1.3"）固定于位置的皮肤电极阵列；（"6.1.4"）包含单股电线的电缆以及 皮肤电穿孔手柄和皮肤EP装置单位之间的信号；（"6.1.5"）单股电线，其细节描述于图8的 电线图解中；（"6.2.1"）触发器图解；（"6.2.2"）LED图解；（"6.2.3"）描述了用于在完成电穿 孔脉冲序列后辅助从皮肤电极手柄弹出的皮肤电极阵列的凸起的脊(raisedridge)的图 解；（"6.2.4"）皮肤电极阵列的针状电极图解；（"6.2.5"）固定于手柄上的皮肤电极阵列的 侧视图图解；（"6.2.6"）锁臂和锁销(手柄上）的图解；（"6.2.7"）描述用于接收和进行回路 连接接触的皮肤电极内部插座的图解；（"6.2.8"）描述包含单股电线的电缆的图解，该电线 的细节显示于图8。
[0041 ]图7显示了安装于手柄上的皮肤电极阵列：（"7.Γ)用于接收和产生皮肤电极阵列 中单个针状电极和皮肤电极手柄之间的电连接的单个插座的侧视图图解。
[0042]图8显示阵列和手柄组件的电线图解。
[0043]图9显示了允许治疗受试者之间无菌加载手柄的多个皮肤电极阵列蛤壳式折叠包 装容器：（"9.1"）盖子；（"9.2"）基底，包括用户设计的用于放置阵列的单个的孔；（"9.3"）孔 的侧视图；以及
[0044]图10显示了GEP在注射了不同量的质粒pSP5-12-GFP并使用皮肤电极阵列和皮肤 特异性EP条件(MA)用EP装置电穿孔的动物中的平均表达水平，与通常用于向骨骼肌(LA)递 送质粒的电极和条件相比。
[0045] 图11显示了三电极针阵列，其中距离L=kxn，其中η表示电极数量而k表示比例常 数。
[0046]图12显示了使用各自的SEAP表达质粒从电穿孔的时间开始11天中SEAP表达水平 (pg/mL/kg)的图片。
[0047]图13显示了多个样品第11天的SEAP表达水平以及相关ELISA结果(平均抗体稀释） 一起的图片。
[0048]图14显示了使用各自的表达IGF-1质粒从电穿孔的时间开始11天中IGF-1表达水 平(mg/mL)的图片。
[0049] 图15展示了在猪的皮肤中给予ID/SQ质粒接着进行电穿孔(EP)之后的绿色荧光蛋 白的荧光图像。以不同剂量和体积使用通常用于M+EP(A)的较大EP阵列或皮肤EP(B)递送 质粒。
[0050] 图16展示的图片显示了给予pSEAP之后的4-11天猪血清中检测到的分泌型胚胎碱 性磷酸酶(SEAP)的水平。动物以浓缩制剂(1Omg/mL)或常规制剂(2mg/mL)(η= 5/组)接受相 同的质粒剂量(lmg)。数据以小组平均应答土SEM表示。
[0051]图17图解了非人灵长类的实验设计：图17A显示了在第0和第4周用低剂量(各抗原 0.2mg)HIV-l免疫原和质粒编码的猕猴IL-12免疫猕猴两次;接着在第8和12周用高剂量(各 抗原1 .〇mg)免疫两次。约每两周采集血样用于免疫分析。每次免疫之后的两周进行 ELISpots并且在第0、4、8、12和18周进行ELISAs。图17B展示了电极阵列和手柄的图解。皮肤 EP由具有3个无菌不锈钢，规格26电极(3-5nm长)的单次使用阵列组成。将阵列连接至装置 的手柄施用器;可通过按压手柄施用器上的触发器按钮启动EP过程。
[0052]图18展示的图片显示了ID/SQ共注射质粒编码的IL-12之后进行EP对HIV-1免疫原 的细胞免疫应答增强。各次免疫后两周进行IFNyELISpots。对env的应答用白色柱形表示 而gag表示为黑色柱形，数据以叠加小组平均应答±SEM表示。
[0053]图19的图片显示了使用ID/SQEP对HIV-1免疫原的记忆应答增强。最后一次免疫后 10周进行ELISpost测定法以检测ID/SQ和ID/SQ+EP组中对gag和env的抗原特异性记忆应 答。数据以小组平均应答土SEM。
[0054] 图20的图片显示了ID/SQ免疫HIV-lgag、env和质粒rhIL-12之后对ThI而不是Th2介 导的细胞应答的诱导。10周时进行IL-4ELISp0t以检测对gag或evn-特异Th2应答的诱导。对env的应答以白色柱形表示，gag以黑色柱形表示，数据以叠加小组平均应答土SEM。
[0055]图21的图片展示了p24(21A)和gpl60(21B)抗体的诱导。在第0、4、8、12和18周收集 血清。分别通过P24和gpl60ELISA测定ID/SQ和ID/SQ+EP免疫组中的gag和env抗体滴度。数 据以小组平均应答土SEM表示。
[0056] 图22的柱形图显示了在不同小鼠肌肉中测定的SEAP表达。将10ygC5-12-SEAP质 粒注射入小鼠的胫骨前肌(TA)和腓肠肌(G)并在4s或80s延迟后进行EP。也给小鼠注射10yg C5-12-SEAP而不进行EP(未EP)。与接受质粒而未EP的对照小鼠相比ΤΑ肌和G肌注射小鼠的 血清SEAP水平更高fP<1.3E-21)。注射了不含质粒骨架(ΝΒ)的表达盒并接着进行电穿孔 的小鼠比未ΕΡ的ΝΒ组具有更高的SEAP水平。但是，ΝΒ组显著低于在相同肌肉给予C5-12-SEAP的小鼠（NB4s与TA4s相比，<0.008 ;NB80s与TA80s相比WP<0.004)。进行ΤΑ肌注射的 小鼠比进行G肌注射的小鼠产生更高的表达并且将TA肌注射与EP之间的延迟从80s降低至 4s不影响表达。
[0057]图23的条形图显示了分别以2mg/mL或10mg/mL以总体积25或5yL肌肉αΜ)或皮下 (ID)注射50ygCMV-EGFP质粒之后在小鼠中定量的平均GFP表达。与给予2mg/mL浓度（（ID和 頂，乍= 0.01)的动物相比给予10mg/mL浓度的小组中GFP表达最高，尽管相互比较时ID和IM 注射位点得到相似的总体评分。
[0058] 图24的柱形图显示了由普遍存在的CMV启动子驱动在各种电流设置下在小鼠不同 肌肉中测定的SEAP表达。检测质粒制剂:盐水、盐水+LGS或水+LGSJA肌肉中于0.1A的盐水+ LGS制剂产生最高表达。接受配制于水中的质粒并以0.2A电穿孔的动物产生与相同肌肉接 受0.1A的动物相比显著较低的SEAP水平〇4，$<0.05;6，，<0.001)。当水+1^用作质粒 制剂时，TA肌肉的血清SEAP水平的差异不显著，而G肌肉的差异显著(@P<0.04)。
[0059] 图25显示了治疗后14天测定的抗SEAP抗体的滴度，其在用0.1A电流在G肌肉（当质 粒配制于(A)盐水+LGS中时)和在TA肌肉（当配置于水+LGS中时)处理的小鼠中最高。
[0060] 图26显示了继电接触矩阵实施方案的图解。
[0061]图27A显示了电穿孔功能性电流流程图的第一部分。
[0062] 图27B显示了电穿孔功能性电流流程图的第二部分。
【具体实施方式】
[0063] 提供以下缩略或简写定义以帮助理解本发明的优选实施方案。本文提供的缩略定 义并不是详尽的并且不与本领域所理解的定义或字典意义相悖。本文提供缩写定义以补充 或更明确地定义本领域已知的定义。
[0064] 术语"恒定电流"在本文中用于定义组织或组成所述组织的细胞在递送至相同组 织的电脉冲过程中接受或经受的电流。电脉冲递送自本文所述电穿孔装置。该电流在电脉 冲过程中在所述组织中维持恒定安培因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选即时 反馈。反馈元件可测定在整个脉冲过程中组织(或细胞)的电阻并使电穿孔装置改变其电能 输出（例如增加电压)使得相同组织中的电流在整个电脉冲过程中以及脉冲与脉冲之间保 持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包含控制器。
[0065] 术语"反馈"或"电流反馈"可替换使用并意指所提供皮肤EP装置的活性应答，其包 括测定电极之间组织的电流并据此改变由EP装置递送的能量输出以将电流维持在恒定水 平。恒定水平由使用者在起始脉冲序列或电子治疗之前预先设定。优选通过皮肤EP装置的 电穿孔组件例如控制器完成反馈，因为其中的电流回路可以持续监控电极间组织的电流并 将所监测电流(或组织内的电流)与预设定电流对比并持续进行能量输出调节以维持所检 测电流在预设定水平。在一些实施方案中，反馈环为即时的因为其为类比(analog)闭环反 馈。
[0066] 本文术语"生物分子"用于指核酸序列、蛋白质、脂类、微泡（例如载药囊泡）和药 物。
[0067] 术语"电穿孔"、"电透化作用"或"电动(electro-kinetic)增强"（"EP"）在本文中 可替换使用并指使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中的显微路径(孔）；它们的存在允许生物分 子例如质粒、寡聚核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一边通过至另一边。
[0068]术语"分散(decentralized)电流"在本文中用于定于由本文描述的电穿孔装置的 各种针状电极阵列递送的电流模式(pattern)，其中该模式最小化或优选消除在被电穿孔 组织任何区域电穿孔相关加热的发生。
[0069] 术语"皮肤区域"（或"皮肤组织"）在本文中用于指皮肤组织、真皮、真皮下和真皮 内（"ID"）、皮内，皮下（"SQ"）层。皮肤区域不包括肌肉组织。
[0070] 术语"基本不刺入"在本文中指所关注物体(例如针)刺入不超过约1mm至2mm，并优 选不超过约5mm。
[0071] 术语"反馈机制"在本文中用之于指由软件或硬件(或固件)执行的过程，该过程接 受和对比期望组织的阻抗(递送脉冲能量之前，之间和/或之后）与现有数值，优选电流，并 调节所递送的脉冲能量以达到预设定的数值。术语"阻抗"在本文中在描述反馈机制时使用 并可根据欧姆定律转化成电流值，从而可与现有电流比较。在优选的实施方案中，通过类比 闭环回路进行"反馈机制"。
[0072] 本发明的一方面设计本发明的电穿孔装置和它们向期望哺乳动物组织递送能量 脉冲并维持其中的恒定电流的能力，该组织优选为皮内或皮下组织。优选地，电穿孔装置为 皮肤电穿孔装置（"皮肤EP装置"）。皮肤EP装置在EP过程中优选刺入皮肤组织而基本不刺入 肌肉组织。该装置通过可此图皮肤组织例如皮内和皮下组织的皮肤针状电极递送能量脉冲 并传送能量脉冲以及在能量脉冲过程中和整个电穿孔过程中维持组织中的恒定电流。本文 描述的可维持被处理组织中恒定电流的皮肤EP装置的响应性通过皮肤EP装置的反馈机制 达成，其可防止组织加热并降低组织受损、疼痛以及促进所提供皮肤电穿孔技术的整体成 功。该反馈机制是本文描述的某些软件或硬件(或固件）的功能并优选为硬件的功能。在反 馈机制为软件一部分的实施方案中，该类软件与控制皮肤EP装置操作的控制器电子连接并 接受来自中枢皮肤电极的阻抗、比较现有电流与该阻抗并调节递送至期望组织的脉冲以在 组织中维持恒定电流。
[0073]在本发明的一个实施方案中提供了经装配可向期望组织递送能量脉冲并产生与 使用者输入的现有电流相似的恒定电流的电穿孔装置。该电穿孔装置包含电穿孔组件和皮 肤电极组件。电穿孔组件可包括以及并入一个或多个皮肤EP装置的各种元件，包括:控制 器、电流波形发生器、阻抗检测器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆组 件、电源和电源开关。在一些实施方案中，电穿孔组件可作为皮肤EP装置的一个元件发挥功 能，其它元件为与电穿孔组件相连的单独元件(或组件）。在一些实施方案中，电穿孔组件可 作为皮肤EP装置的一个或多个元件发挥作用，其可进一步连接至与该电穿孔组件分离的皮 肤EP装置的其他元件。本发明不受作为机电或机械装置一部分的皮肤EP装置的限制，因为 这些元件可作为相互之间相连的装置或分离元件。电穿孔组件可递送在期望组织中产生恒 定电流的能量脉冲并包括反馈机制。皮肤电极组件包括在空间排布中具有多个皮肤电极的 电极阵列，其中该皮肤电极组件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并通过皮肤电极将其递送 至期望组织。在能量脉冲递送中至少多个皮肤电极之一为中性的，测定期望组织中的阻抗 并将阻抗传递至电穿孔组件。该反馈机制可接受已测定的阻抗并可调节电穿孔组件递送的 能量脉冲以维持恒定电流。在一些实施方案中，期望组织为皮肤组织并优选皮下组织或皮 内组织。
[0074]图2A显示了本文提供的EP装置的优选实施方案的体系图解。该图解显示了EP装置 的主要功能元件，但是仅用做说明目的因为并不是所有功能元件对于所有的实施方案都是 必需的。以各元件的硬件功能描述各元件。由硬件启用的事件序列可由软件控制，如本文所 述。该装置的中心元件为该实施例中的控制器。控制器的一个实例图解显示于图2B，其为微 控制器，其在一些实施方案中为TexasInstrumentsmsp430F149或Motorο1a 68HC908AZ60A。其它可选择的控制器为电子工程领域技术人员已知并可轻易取代上述例证 性实例。
[0075]在一些实施方案中，皮肤电极为针状电极、导电杆或导电薄膜区域并优选针状电 极。优选地，针状电极可与皮内或皮下组织接触并基本不刺入肌肉组织。在一些实施方案 中，该组织电极可安装于基座上，其可为塑料材料，形成具有皮肤电极阵列（或皮肤阵列或 皮肤针阵列）的可替代或可替换皮肤电极，其可与本文所述的皮肤EP装置相连使用。在一些 实施方案中，该皮肤电极的长度可为约1mm至20mm; 1mm至12mm; 2mm至10mm; 2mm至7mm;或长 约5mm。在一些实施方案中该皮肤电极可为规格22或28;规格23至27;规格24至27，或约规格 26。优选地，该皮肤电极长约5mm并为规格26。在一些实施方案中该皮肤电极仅为真正与患 者皮肤接触的皮肤EP装置的一部分（以防止交叉污染）。可向所选区域递送疫苗制剂，该区 域被皮肤阵列包围并且皮肤电极插入皮肤中。该皮肤阵列优选在插入皮肤的皮肤电极四周 产生均一压力，并藉此辅助在目标区域的EP过程中生成均一的电场。
[0076] 在一些实施方案中，该皮肤电极组件进一步包含:活化器开关以及可报告皮肤电 极组件活化的状态指示器。在一些实施方案中，该电极阵列包含至少三个皮肤电极并优选 具有三角形空间排布的三个电极。优选地，该三角形为等腰三角形。在一些实施方案中，电 极阵列包含空间排列成等腰三角形的三个皮肤电极，其腰长为5mm并且底边长3mm。在一些 实施方案中，该电极阵列为一次性的并与皮肤电极组件可移除性地相连。优选地，该一次性 电极阵列为皮肤电极盘并更优选该皮肤电极盘为无菌的。
[0077] 在一些实施方案中，多个皮肤电极可以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方案 中，该多个皮肤电极可在程序化序列下通过控制皮肤电极以分散方式递送能量脉冲，并且 该程序化序列由使用者输入值电穿孔组件中。在一些实施方案中，该程序化序列包含按序 列传送的多个脉冲，其中多个脉冲的各脉冲由至少两个(一个中性电极测定阻抗)活性皮肤 电极递送，并且其中多个脉冲的后续脉冲由至少两个活性电极的另外一个递送并具有一个 中性皮肤电极测定阻抗。
[0078] 在一些实施方案中，反馈机制由硬件或软件执行。优选地，该反馈装置由类比闭环 回路执行。优选地，该反馈每50μ8、20μ8、10μ8或1μ8发生但是优选实时反馈或即时（即由测 定响应时间的可用技术测定为基本即时）。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的 阻抗并将阻抗传递至反馈机制，反馈机制响应该阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在 与现有电流相似的数值。在一些实施方案中，该反馈机制可在能量脉冲的传递中持续和即 时维持恒定电流。
[0079] 在一些实施方案中，该皮肤电穿孔装置也包括接受来自使用者的输入的控制器并 控制电穿孔组件根据输入递送能量脉冲。在一些实施方案中，该控制器接受来自使用者的 输入并控制电穿孔组件根据输入递送能量脉冲。优选该控制器为单芯片微控制器。
[0080] 在一些实施方案中，皮肤ΕΡ的元件为控制器，其可控制与其连接或与其相连的各 种外接装置。该控制器用于管理电穿孔程序，其包括以下操作：（1)通过控制电流波形生成 器为电极组件生成电穿孔点火序列或恒定电流脉冲模式；（2)进行阻抗检测以确定是否进 行电脉冲；（3)传感和处理使用者指