多能哺乳动物细胞的体外胰腺分化的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诱导多能哺乳动物细胞中的胰腺分化。
【背景技术】
[0002] 胰腺0细胞的生成代表了再生医学的主要目标。事实上，这些细胞的大量供应将 使基于细胞的糖尿病疗法得以发展，该疗法目前受限于缺乏捐赠器官和在体外扩大胰岛素 分泌细胞的难度。胚胎来源（人类胚胎干细胞或hESC)[l]或由重编程体细胞（人类诱导 多能干细胞或hIPSC) [2]产生的人类多能干细胞（hPSC)提供了绕过这些限制的前景。事 实上，这些细胞能够在体外无限增殖，同时保持分化成各种类型细胞的能力，包括胰腺祖细 胞[3-6]。然而，在确定成分培养条件下允许生成这些细胞的同质群体的健全的方法尚未确 立。实际上，现有的方法包含一些未限定的动物产品，如饲养物、胎牛血清（FBS)和基质胶。
[0003] 此外，它们只允许细胞的异质群体的产生，因而增加了移植后的畸胎瘤形成的风 险[7,8]。它们也似乎仅在有限的几个hPSC细胞系[3]上起到有效作用，这妨碍了它们在 很多实验室中的应用。
[0004] 大多数目前用于hPSC直接分化的培养系统模仿正常发育，因为这种方法可以促 进全功能的细胞类型的生成。因此，来自于小鼠或其它脊椎动物模型研宄的知识已被用来 提供人类hPSC向特定种系发展的策略的信息。
[0005] 胰腺和肝脏约在胚胎第8. 5天到9. 5天，在诱导信号的影响下从发育中的原始前 肠的相邻区域出现，这些诱导信号由附近的中胚层分泌[9]。这些信号有可能指挥对胰腺特 化必要的转录因子的表达，如标志着胰芽形成前的背侧前肠的HXLB9[10,11]和标志着腹 侧和背侧胰芽出现的前肠区域的H)X1 [12,13]。
[0006] 新形成的胰腺祖很快表达其它的标志物，包括PTF1A、NKX6. 1和S0X9,这些祖细胞 产生了胰腺的内分泌（胰岛）和外分泌（腺泡和导管细胞）细胞。类似的机制控制着肝的 特化，虽然它们涉及不同的转录因子组，如HEX、GATA6、PR0X1和HNF4 a [14]和不同的信号 传导通路，如BMP和的FGF[15]。虽有这样广泛的知识，但是用以协调胰腺或肝祖细胞转录 网的细胞外信号传导通路的分子机制，尤其是在人体内的机制，仍有待阐明，而且hPSC可 能具有独特的优势来完成这一主要任务。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及一种用于多能细胞体外高效分化成胰腺祖细胞和胰腺内分泌细胞的 方法。本方法对于例如在基于细胞的疗法或疾病建模中产生胰腺细胞可能是有用的。
[0008] 本发明的一个方面提供了一种产生胰腺祖细胞的细胞群的方法，包括：
[0009] i)提供多能细胞的细胞群；
[0010] ii)在定形内胚层（DE)诱导培养基中培养该细胞群，以产生定形内胚层细胞的细 胞群，其中，所述DE诱导培养基含有TGF0配体、成纤维细胞生长因子（FGF)、骨形态发生蛋 白（BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3 0抑制剂；
[0011] iii)在第一胰诱导培养基中培养定形内胚层细胞的细胞群，以产生背侧前肠细胞 的细胞群，该第一胰诱导培养基含有激活素拮抗剂；FGF;视黄酸；和BMP抑制剂；
[0012] iv)在第二胰诱导培养基中培养背侧前肠细胞，该第二胰诱导培养基含有FGF、视 黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂；
[0013] v)在第三胰诱导培养基中培养内胚层细胞，该第三胰诱导培养基含有FGF ;
[0014] 从而产生胰腺祖细胞的细胞群。
[0015] 所述胰腺祖细胞可进一步分化成胰腺内分泌细胞。例如，一种方法可以进一步包 括；
[0016] (vi)在第一内分泌诱导培养基和第二内分泌诱导培养基中培养胰腺祖细胞的细 胞群，以产生胰腺内分泌细胞的细胞群。
[0017] 多能细胞是一种显示出未分化的表型的细胞，具有潜在的多能性，即它能够分化 成三个胚层（内胚层、中胚层和内胚层）中的任何一层的任何胎儿或成人细胞类型。多能 细胞不同于全能细胞，其不能产生胚外细胞系。多能细胞可以表达下列多能相关标志物中 的一种或多种：0ct4、Sox2、碱性磷酸酶、P0U5fl、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4 和c-myc，优选为P0U5f 1、NAN0G和S0X2。人类多能细胞可能会缺乏与特定分化命运相关的 标志物，如 Bra、Soxl7、FoxA2、a FP、Soxl、NCAM、GATA6、GATA4、Handl 和 CDX2〇
[0018] 多能细胞可以是哺乳动物细胞，优选为人类细胞。
[0019] 多能细胞群可以是克隆的，即从单个共同的祖先细胞传代而来的遗传上相同的细 胞。
[0020] 适用于本方法的多能细胞群可以基本上不含一种或多种其它细胞类型。多能细 胞可以是，例如，使用本领域技术人员所公知的任何技术由其他类型的细胞中分离而来，上 述本领域技术人员所公知的任何技术包括那些基于依靠抗体和磁珠或荧光激活细胞分选 (MACS或FACS)的细胞外表位识别的技术，这些技术包括使用抗在干细胞上发现的分子的 胞外区域如SSEA4的抗体。
[0021]多能细胞可以包括胚胎干细胞（ESC)、胎儿和成人体干细胞和iPS细胞。
[0022] 合适的胚胎干细胞可以用常规技术来获得。例如，ESC细胞可以由培养的ESC 细胞系中获得，例如，从hESC细胞系中获得。许多培养的hESC细胞系是可从储存库（例 如，美国国立卫生研宄院的人类胚胎干细胞登记处）公开获得的，如CHB-1至CHB-12、 RUES1 至 RUES3、HUES1 至 HUES28、HUES45、HUES48、HUES49、HUES53、HUES62 至 HUES66、 WA01 (HI)、WA07 (H7)、WA09 (H9)、WA13 (H13)、WA14 (H14)、NYUES1 至 NYUES7、MFS5 和 UCLA1 至UCLA3。合适的人类胚胎干细胞系的其它实例在这些文献中描述（Thomson JA等人.科 学 282:1145-1147 (1998) ;Reubinoff 等人.自然生物技术 18:399-404(2000) ;Cowan，C. A.等人?英格兰医学杂志.350,1353-1356(2004)，Gage, F.H.等人?神经科学年度评 论.18159-192(1995);以及 Gotlieb (2002)神经科学年度评论 25381-407) ;Carpenter 等 人?干细胞.5(1) :79-88(2003)。潜在临床级hESC在Klimanskaya，I.等人?柳叶刀365， 1636-1641(2005)以及 Ludwig, T.E?等人.自然生物技术.24,185-187 (2006)中有描述。
[0023] 合适的hESC可以在不破坏人类胚胎的情况下获得。
[0024] 在其他【具体实施方式】中，所述多能细胞不是hESC，并且可以是，例如，胎儿或成人 体干细胞或iPS细胞，优选为人类iPS细胞。
[0025] iPS细胞是由非多能、完全分化的始祖细胞衍生而来的多能细胞。合适的始祖细胞 包括成人成纤维细胞和外周血细胞。始祖细胞通常通过引入多能性基因或蛋白，如0ct4、 Sox2和Soxl到细胞内进行重编程。上述基因或蛋白可以通过任何合适的技术，包括质粒 或更优选为病毒转染或直接蛋白输送，被引入分化的细胞内。其它基因，例如Kif基因，如 Kif-1、-2、-4 和-5 ;Myc 基因，如 C-myc、L-myc 和 N-myc ;nanog ;以及 Lin28 也可导入细胞 以增加诱导效率。引入多能性基因或蛋白后，可以培养所述始祖细胞。表达多能性标志物 的细胞可被分离和/或纯化，以产生iPS细胞的细胞群。用于产生iPS细胞的技术是本领 域众所周知的（Yamanaka等人自然 2007 ;448 :313-7 ;Yamanaka 6 2007年 6 月 7 日；1(1): 39-49;灯111等人自然.2008 年7月31日；454(7204):646-50;了&1?11^8111细胞.2007 年11 月30日；131 (5):861-72.?&4等人自然.2008年1月10日；451(7175) :141-6;灯11^等人 细胞干细胞.2009年6月5日；4(6):472-6以&11161'山等人.干细胞，2009.9999(999八） ： 无页数）
[0026] iPS细胞可来源于取自没有遗传病症的个体的细胞，如成纤维细胞。衍生自没有遗 传病症个体的iPS细胞可以如本文所述，用以产生具有正常（即非疾病相关的）基因型的 胰腺祖细胞和胰腺内分泌细胞。
[0027] iPS细胞可来源于取自具有不寻常的遗传背景的个体的细胞，如成纤维细胞。例 如，iPS细胞可从取自具有一种胰腺状况，例如糖尿病病症如1型和2型糖尿病的个体的细 胞中、具有一种高风险胰腺状况和/或一种低风险胰腺状况的个体产生。本文所述的由具 有不寻常的遗传背景的个体产生的胰腺细胞可能在研宄胰腺状况，如糖尿病，的机制和确 定治疗靶点中是有用的。
[0028] iPS细胞可以来源于取自具有遗传性疾病的个体的细胞，如成纤维细胞，例如影 响胰腺发育和/或胰腺功能障碍相关的遗传性疾病，包括糖尿病病症（如1型和2型糖尿 病）、胰发育不全、遗传性胰腺炎、家族性胰腺炎、舒-戴二氏综合征（Schwachman-Diamond syndrome)和胰腺癌或具有胰腺症状或并发症的遗传性疾病。遗传性疾病可以包括单基因 疾病。
[0029] 尽管成纤维细胞的样品可以方便地获得，例如真皮成纤维细胞，但是任何具有疾 病的基因型的细胞，都可用以产生iPS细胞，疾病的基因型例如基因突变或缺陷。
[0030] 由取自具有遗传性疾病的个体的细胞产生的iPS细胞可如本文所述地用以生成 具有该遗传性疾病基因型的胰腺细胞，所述遗传性疾病例如影响胰腺发育和/或胰腺功能 障碍相关的遗传性疾病。典型地，所述胰腺细胞会含有与遗传性疾病相关的基因突变或缺 陷。这些细胞可以是对治疗患有如上所述的遗传性疾病的患者或对包括糖尿病病症在内的 胰腺疾病的建模有用的。
[0031] 多能细胞可以用常规的技术从多能细胞系中获得（Vallier，L.等人发育生物 学 275,403-421 (2004)，Cowan，C. A?等人?新英格兰医学杂志.350,1353-1356(2004)， Joannides，A?等人.干细胞 24,230-235(2006)Klimanskaya, I?等人.柳叶刀 365， 1636-1641(2005)，Ludwig，T.E.等人.自然生物技术.24,185-187(2006))。本方法中使 用的多能细胞可以生长在限定的条件下或在饲养细胞上。例如，多能干细胞可以在培养皿 内，在适当密度（例如1〇 5至10 6个细胞/60_皿）的一层饲养细胞上培养，饲养细胞如辐 照小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)，或在一个适当的具备饲养物条件的底物上或定义的培养基 中培养。本方法中使用的多能细胞可通过酶法或机械手段进行传代。用于多能细胞的合适 的培养基包括敲除Dulbecco改良的Eagle培养基（KO-DMEM)，其中添加有20 %的血清替代 品，1%的非必需氨基酸，ImM的L-谷氨酰胺，0.1 mM的|3 -疏基乙醇和4ng/ml至10ng/mL 的 FGF2〇
[0032] 用于多能细胞的其它合适的培养基包括添加有4ng/ml的FGF2的敲除（KS)培养 基；添加有20 %的血清替代品、1 %的非必需氨基酸、ImM的L-谷氨酰胺、0.1 mM的巯 基乙醇和4ng/ml至10ng/mL的人FGF2的敲除Dulbecco改良的Eagle培养基（K0-DMEM); 以及添加有20%敲除血清替代品（!《1〇、61^/1111的？6?2(?印1' 〇1'此11公司）、11111的1-谷氨 酰胺、100 U M的非必需氨基酸、100 y M的2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的 DMEM/F12。
[0033] 在优选的【具体实施方式】中，用于本方法的多能细胞群可以在化学成分确定的培养 基（CDM)中培养，该培养基中含有激活素A(10ng/mL)和FGF2(20ng/mL)，以保持下文所述 的诱导分化前的多能性（Vallier等人，2005)。多能细胞可以使用无胶原酶试剂获得，例如 Accutase?(BioWest 公司）。
[0034] 在一些【具体实施方式】中，多能干细胞可以包括一种报告基因，优选为一种焚光报 告基因，其可操作地连接至一个组织特异性启动子（即胰腺特异性启动子）。分化成如本文 所述的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞后，表达报告基因的细胞可以从其他细胞类型中被分 离和/或纯化出，例如通过荧光激活细胞分选（FACS)。
[0035] 所述多能干细胞可以经过四步过程分化成胰腺祖细胞。首先，多能细胞群被诱导 分化成定形内胚层OE)细胞的细胞群。然后将DE细胞诱导分化成背侧前肠细胞，再经过 两个步骤被诱导分化成胰腺祖细胞。
[0036] 每一步中所述细胞群的分化程度可以在细胞培养期间通过监测和/或检测分化 细胞群中的一种或多种细胞标志物的表达来确定。例如，可以检测分化程度较高的细胞 类型中特征性的标记物表达的提高，或分化程度较低的细胞类型中特征性的标记物表达的 下降。细胞标志物的表达可通过任何合适的技术来确定，包括免疫细胞化学、免疫荧光、 RT-PCR、免疫印迹、荧光激活细胞分选（FACS)和酶法分析。
[0037] 每个步骤之后，该步骤产生的部分分化的细胞群可以是基本上不含其他细胞类型 的。例如，在培养基中培养之后，该群可以包含85%或更多、90%或更多、95%或更多、或 98%或更多的部分分化的细胞。优选地，细胞群不含其它细胞类型的程度已经足够，没有必 要再进行纯化。如果需要的话，部分分化的细胞群可用任何方便的技术进行纯化，如FACS。
[0038] 通过本文所述的方法的一个步骤产生的部分分化的细胞群可以在下一分化步骤 之前被培养、维持或扩大。部分分化的细胞可以通过任何方便的技术进行扩大。
[0039] 每一步的分化诱导涉及在化学成分确定的培养基（CDM)中培养细胞，所述化学成 分确定的培养基优选为人源化CDM，其添加有一组诱导细胞进行分化步骤的分化因子。每个 培养基所列出的一组分化因子最好是详尽的，且培养基可以不含其它分化因子。
[0040] 化学成分确定的培养基（CDM)是用于培养细胞的营养液，其仅包含指定的成分， 优选为已知化学结构的成分。CDM不含不确定的成分或包括不确定成分的组分，如饲养细 胞、基质细胞、血清、基质胶、血清白蛋白和复杂的细胞外基质。优选地，化学成分确定的培 养基是人源化的。人源化化学成分确定的培养基中不含来自非人类的动物的成分或添加 物，如胎牛血清（FBS)、牛血清白蛋白（BSA)和小鼠饲养细胞。条件培养基包括从来自培养 的细胞的不明确的成分，并且不是化学成分确定的。
[0041] 合适的化学成分确定的基础培养基包括高级Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM) (Price等人焦点（2003)25 3-6)。高级DMEM是本领域中公知的技术且可容易地从商业来 源获得（例如生命科技公司，美国）。高级DMEM中的成分示于表1。在一些优选的具体实 施方式中，高级DMEM可以在本文所述的胰诱导培养基中作为基础培养基使用。
[0042] 其它合适的化学成分确定的基础培养基包括CDM-PVA (Johansson和Wiles (1995) 分子细胞生物学15,141-151)，其添加有聚乙烯醇、胰岛素、转铁蛋白和成分确定的脂质。 Johansson 和 Wiles 的 CDM 组成：50% 的頂DM(Gibco 公司）加 50% 的 F12 NUT-MIX(Gibco 公司）；7 y g/ml胰岛素；15 y g/ml转铁蛋白；lmg/ml的聚乙稀醇（PVA ;1 %的化学成分确 定的脂质浓缩物（Invitrogen公司）；和45