分化讨稈中HEX和HLXB9的下调分别阳断肝和腠腺的分化。
[0240] 然后，我们决定利用Def-Panc和Def-H印培养体系研宄激活素控制胰腺和肝细胞 系之间细胞命运选择的机制。为此，我们进行了基因表达谱实验，以确定在胰腺特异性分化 的过程中，通过激活素的存在而被上调或下调的基因。在存在激活素/RA/N〇g/FGF(D45A) 或SB/RA/Nog/FGF(D45SB)的条件下生长36小时的DE细胞的这些分析，揭露了激活素可 激活或阻断基因众多基因的表达，包括HEX和HLXB9,这是众所周知的是前肠发育的必要条 件。因此，我们假设激活素可以通过控制这些转录因子的表达指导DE特异性分化。为了检 验这一假设，我们用稳定表达的shRNA调低了 hESC中HEX或HLXB9的表达。所得的hESC亚 系（ShHEX-hESC和ShHLXB9-的hESC)随后如图1中所示那样分化。Q-PCR分析显示在DE 分化期间HEX表达的下调（图13)与肝标志物如AFP和ALB的下调（图14)呈系统相关。 类似的下降并没有在由ShHLXB9-hESC hESC衍化而成的DE细胞或由稳定过表达非靶向的 shRNA的hESC(ShScramble - hESC)衍化而成的DE细胞中被观察到。但是，我们也观察到 减少的ffiX的表达增加了在VF分化过程中的细胞死亡（图15)。因此，HEX表达似乎对类 VF细胞在体外存活以及向肝细胞系分化是必要的。最后，ShHEX-hESC能够分化成先后表达 HLXB9和H)X1的胰腺祖（图16)。
[0241] 对ShHLXB9-hESC进行的相似的实验表明，在前肠分化过程中HLXB9表达的下调急 剧地降低了胰腺祖标志物包括roXl/S0X9的表达（图17)。有趣的是，HLXB9表达的减少 没有影响前肠标志物如HNF4 a、F0XA2和HNF1 0的表达（图17)，从而提供了指示：HLXB9 对于背侧前肠特异性分化不是必需的，但是对于其向胰腺细胞系的分化是必需的。重要的 是，HLXB9在肝分化期间不表达（图18)，因此从ShHLXB9-hESC生成的DE细胞在激活素存 在时，能分化成类VF细胞以及分化成肝胚层。总的来说，这些结果概括了在小鼠胚胎中进 行的研宄，表明ffiX的缺失破坏了肝芽发育，却不会影响背侧胰腺特异性分化，而HLXB9是 诱导H)X1在胰腺中表达的必要条件（Habener JF等人（2005)内分泌学146 :1025-1034)。 因此，它们表现出我们的培养体系在DE发育建模和体外早期胰脏和肝脏器官形成研宄中 的普遍适用。
[0242] 允许在兼容临床应用的培养条件下，从hPSC生成肝脏和胰腺祖细胞的同质群的 健全的方法尚未确立。实际上，可获得的方法通常包含未明确的动物产品，如饲养物或胎牛 血清（FBS)。为了应对这些挑战，我们确定了明确的培养条件，以使来自多种hPSC细胞系的 人定形内胚层（DE)分化为胰腺和肝脏内胚层的近同质细胞群。
[0243] RA被认为在促进胰腺特异性分化中具有重要的功能，而BMP信号传导阻断了胰腺 标志物H)X1的表达，巩固了之前的研宄（Mfopou等人（2010)胃肠病学138 :2233-2245， 2245 e2231-2214 ; [Cai等人（2010)分子细胞生物学杂志2 :50-60)。然而，我们涉及到FGF 信号传导功能的结果与之前的研宄（Ameri J等人（2010年）干细胞28 :45-56)相抵触，我 们的结果表明FGF起到胰腺特化的容许信号的作用，而不是诱导信号的作用。这种明显的 差异可能是由于在我们的培养条件下不存在饲养物、血清和基质胶?，所有这些都包含未知 组分，它们很容易干扰FGF信号传导。
[0244] 此外，我们观察到FGF信号传导的抑制减少了胰腺祖细胞的存活，从而证明了在 我们的方法中使用了 FGF。更重要的是，我们的分析还表明，激活素/TGF 0通过在促进肝细 胞系的同时，抑制背侧前肠OF)特异性分化，从而控制DE细胞向胰腺细胞系的命运选择。 以前的研宄已经表明，TGFb信号传导控制着小鼠胚胎中的腹侧胰芽的诱导（Wandzioch E， Zaret KS(2009)科学324 :1707-1710)，因此，我们的数据首次表明类似的机制可以发生在 背侧胰腺中，从而证实了我们的培养体系对于体外前肠发育建模的益处。
[0245] 最后，这些结果具有重要的现实意义，因为现有的从hPSC生成胰腺细胞的方法往 往依赖于饲养物、基质胶?和血清，所有这些都代表了潜在的TGF0信号传导来源，TGF0信 号传导具有降低胰腺特异性分化的能力。此外，最近的研宄表明，Nodal表达的内源水平可 决定特定hIPSC细胞系分化成为胚层衍生物的能力（Ramos-Mejia V，Melen GJ，Sanchez L 等人，（2010)分子疗法18:2173-2181)。Nodal/TGF0生长因子内源水平的这种差异可能 影响不同hPSC细胞系分化为胰腺祖的能力，且用SB抑制这一信号传导途径可以绕过这个 限制。因此，我们目前用我们的4步方法分化了 10个hIPSC细胞系成为胰腺祖，并且我们 观察到，只有那些未能分化成DE的hIPSC细胞系（10个中有2个）也缺乏分化为胰腺细胞 的能力。在DE分化过程中抑制TGF0信号传导的另一优点在于消除污染的多能细胞的可 能性。事实上，我们和其他人已经广泛地证明，激活素/Nodal/TGFf3信号传导的抑制诱导 了 hPSC的分化（Vailier Let等人，（2009)发育136 :1339-1349)。因此，在DE特异性分化 过程中抑制激活素可以减少由未分化的细胞造成的污染。因此，我们在移植胰腺祖细胞的 小鼠中从未观察到畸胎瘤的形成。因此，在胰腺特异性分化过程中抑制激活素信号传导可 以允许生成用于基于多能细胞的疗法的"更安全"的胰腺祖。
[0246] 总结，我们的研宄可以极大地方便用于临床应用的、在确定的培养条件中的胰和 肝细胞的同质细胞群的生成。然而，这种培养体系还提供了一个强大且高效的用于研宄人 内胚层分化的体外发育模型。
【主权项】
1. 一种产生胰腺祖细胞的细胞群的方法，包括： i) 提供多能细胞的细胞群； ii) 在定形内胚层（DE)诱导培养基中培养所述细胞群，以产生定形内胚层细胞的细胞 群，其中，所述定形内胚层（DE)诱导培养基包括TGF0配体、成纤维细胞生长因子（FGF)、骨 形态发生蛋白（BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3 0抑制剂； iii) 在第一胰诱导培养基中培养所述定形内胚层细胞的细胞群，以产生背侧前肠细胞 的细胞群，所述第一胰诱导培养基包括激活素拮抗剂；FGF ;视黄酸；和BMP抑制剂； iv) 在第二胰诱导培养基中培养所述背侧前肠细胞，所述第二胰诱导培养基包括FGF、 视黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂； V)在第三胰诱导培养基中培养所述内胚层细胞，所述第三胰诱导培养基包括FGF ; 从而产生胰腺祖细胞的细胞群。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，定形内胚层（DE)诱导培养基是一种化学成分 确定的培养基，它包括TGF0配体、成纤维细胞生长因子（FGF)、骨形态发生蛋白（BMP)和 PI3K抑制剂。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述定形内胚层（DE)诱导培养基是一种 化学成分确定的培养基，由添加有激活素、成纤维细胞生长因子（FGF)、骨形态发生蛋白 (BMP)和LY294002的基础培养基组成。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，细胞在所述培养基中培养2至4天，以产生DE细 胞的细胞群。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤（ii)包括： (a) 在所述DE诱导培养基中培养多能细胞的细胞群，其中，所述DE诱导培养基进一步 包括GSK3 0抑制剂， (b) 在不含GSK30抑制剂的定形内胚层诱导培养基中进一步培养所述细胞群；以及， (c) 在含有TGF0配体和成纤维细胞生长因子的前定形内胚层（ADE)诱导培养基中进 一步培养所述细胞群以生成定形内胚层（DE)细胞的细胞群。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述定形内胚层（DE)诱导培养基是一种化学成 分确定的培养基，由添加有激活素和成纤维细胞生长因子（FGF)的基础培养基组成。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述细胞群在步骤a)至c)的每一步中培养 24小时。
8. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述定形内胚层细胞表达S0X17、 CXCR4 和 GSC。
9. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述第一胰诱导培养基是一种化 学成分确定的培养基，它包括激活素/TGF-0拮抗剂；FGF ;视黄酸；和BMP拮抗剂。
10. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述第一胰诱导培养基是一种化 学成分确定的培养基，由添加有SB-431542 ;FGF ;视黄酸；和头蛋白的基础培养基组成。
11. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述背侧前肠细胞表达RFX6、 F0XA2、HNFlb、S0X2、HNF4a 和 HLXB9。
12. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述第二胰诱导培养基是一种化 学成分确定的培养基，它包括FGF、BMP拮抗剂、视黄酸和hedgehog信号传导抑制剂。
13. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述第二胰诱导培养基是一种化 学成分确定的培养基，由添加有FGF ;视黄酸；头蛋白；和KAAD-环巴胺的基础培养基组成。
14. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述第三胰诱导培养基是一种化 学成分确定的培养基，它包括FGF。
15. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述第三胰诱导培养基是一种化 学成分确定的培养基，由添加有FGF的基础培养基组成。
16. 根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述第三胰诱导培养基还包含视黄酸。
17. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述胰腺祖细胞表达roxi、 S0X9、HNF6、NKX6. 1 和 PTFla。
18. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，包括使胰腺祖细胞成熟以产生胰腺内 分泌细胞的细胞群。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述胰腺祖细胞通过以下步骤成熟i)在第一 内分泌诱导培养基中培养和ii)在第二内分泌诱导培养基中培养，以产生所述胰腺内分泌 细胞的细胞群， 其中，所述第一内分泌诱导培养基是化学成分确定的培养基，包括Notch信号传导抑 制剂；且所述第二内分泌诱导培养基是不含分化因子的化学成分确定的培养基。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述第一内分泌诱导培养基是由一种补充基 础培养基和N-[N-(3, 5-双氟苯乙酰基）-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT)组成 的一种化学成分确定的培养基；以及所述第二内分泌诱导培养基是由补充基础培养基组成 的一种化学成分确定的培养基。
21. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述胰腺祖细胞通过以下步骤成熟i)在第一 内分泌诱导培养基中培养和ii)在第二内分泌诱导培养基中培养，以产生所述胰腺内分泌 细胞的细胞群， 其中，所述第一内分泌诱导培养基是化学成分确定的培养基，包括Notch信号传导抑 制剂和视黄酸；且所述第二内分泌诱导培养基是除了视黄酸以外不含分化因子的化学成分 确定的培养基。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述第一内分泌诱导培养基是由补充基础培 养基、N-[N-(3, 5-双氟苯乙酰基）-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT)和视黄酸 组成的一种化学成分确定的培养基；以及所述第二内分泌诱导培养基是由补充基础培养基 和视黄酸组成的一种化学成分确定的培养基。
23. 根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中，所述胰腺内分泌细胞表达 NGN3、INS、SST 和 GLU。
24. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，包括监测和/或检测在分化中的细胞 的所述细胞群中的一种或多种细胞标志物的表达。
25. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，包括扩大所述胰腺祖细胞的细胞群或 所述胰腺内分泌细胞的细胞群。
26. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，包括培养和维持所述胰腺祖细胞的细 胞群或所述胰腺内分泌细胞的细胞群。
27. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，包括存储所述胰腺祖细胞的细胞群，或 所述胰腺内分泌细胞的细胞群。
28. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，包括将所述胰腺祖细胞的细胞群、所述 胰腺内分泌细胞的细胞群或所述胰腺内分泌细胞的细胞群与一种治疗上可接受的赋形剂 混合。
29. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述多能细胞是人多能细胞。
30. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述多能细胞是ESC或iPSC。
31. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述多能细胞是来自于具有与胰 腺病症相关的遗传背景的个体的iPS细胞。
32. 根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述多能细胞是来自于具有与胰 腺病症相关的遗传疾病的个体的iPS细胞。
33. -种通过权利要求1至32中任一项所述的方法产生的分离的胰腺祖细胞的细胞群 或胰腺内分泌细胞的细胞群。
34. -种根据权利要求33所述的细胞群，其中，所述分离的胰腺祖细胞或胰腺内分泌 细胞具有一种疾病相关的基因型。
35. -种用于治疗人体或动物体的方法的根据权利要求34所述的细胞群。
36. -种用于治疗一种胰腺病症的根据权利要求35所述的细胞群。
37. -种治疗患有胰腺病症的患者的方法，包括； 向一个有需要的个体施用根据权利要求33所述的分离的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺 内分泌细胞的细胞群。
38. 根据权利要求33所述的一种细胞群在用于治疗具有胰腺病症的患者的药物的制 备中的应用。
39. 根据权利要求36至38中的任一项所述的细胞群、方法或应用，其中，所述胰腺病症 是一种糖尿病病症。
40. 根据权利要求39所述的细胞群、方法或应用，其中，所述糖尿病病症是1型糖尿病 或2型糖尿病。
41. 一种筛选化合物的方法，包括： 让根据权利要求33或34所述的分离的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞与一种测试化合 物接触，以及； 确定测试化合物对所述胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞上的影响和/或所述胰腺祖细 胞或胰腺内分泌细胞对测试化合物的影响。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中，所述测试化合物对增殖、胰岛素表达、胰岛素 分泌；葡萄糖响应性中的一个或多个的影响被确定。
【专利摘要】本发明涉及多能细胞在体外分化为胰腺祖细胞，通过i)在定形内胚层(DE)培养基中培养多能细胞以生成定形内胚层细胞的细胞群，该培养基包括TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3β抑制剂，ii)在第一胰腺培养基中培养定形内胚层细胞以生成背侧前肠细胞的细胞群，所述第一胰腺培养基含有激活素拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP抑制剂；iii)在第二胰腺培养基中培养所述背侧前肠细胞，所述第二胰腺培养基含有FGF、视黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂，以及；iv)在第三胰腺培养基中培养内胚层细胞，所述第三胰腺培养基含有FGF。这样生成的祖细胞可以进一步分化成胰腺内分泌细胞。这些方法可能是有用的，例如，在生成胰腺细胞用于治疗或疾病建模时。
【IPC分类】C12N5-071
【公开号】CN104755607
【申请号】CN201380055066
【发明人】鲁多维奇·瓦利耶, 卓欣樺
【申请人】剑桥企业有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年9月16日
【公告号】EP2898063A1, US20150225698, WO2014044646A1