CID小 鼠的肾囊下。在不同的时间间隔从尾部移取血样进行C-肽分析。在指定的时间点获取肾 脏，并将含有移植细胞的部分在4%多聚甲醛中固定、蜡包埋并处理用于免疫组织化学法。 用3, 3' -二氨基联苯胺（DAB)使抗体结合可见。
[0216]微阵列图谱
[0217] 使用RNeasy?Mini试剂盒，根据制造商的方案（Qiagen公司）提取总RNA。RNA 样品在微阵列上杂交之前，首先评估它们的RNA完整性。采用制造商的标准方法，对第4. 5 天和第4. 5天-激活素+SB的分化的hESC中每个条件下的五个生物学重复样本与11 lumina 的人HT-12v4. 0R1表达微珠芯片进行杂交。没有通过Illumina信号检测的微珠芯片探针 集，在至少一个样品组的所有重复样本中统计的阈值p〈〇. 01的被去除而不进行下一步的 分析。对于所有的样品，剩余的探针集进行背景校正、归一化并使用RMA模型23的默认 参数进行总结。阵列处理使用用于R统计编程语言的Bioconductor软件套装的微珠阵 列包进行。探针集使用由生产商提供的转录信息注释。所描述的原始微阵列数据已经上 传到 ArrayExpress 库（EBI)中（实验名称：Vallier hESC 内胚层。ArrayExpress 加入： E-MEXP-2373分化调节分析）。在Bioconductor的limma包中进行的24的改良t检验法 (moderated t-statistic)被用来评估样本组之间的差异基因（探针集）表达的显著性。 为了减少与这种规模下的多重假设检验相关联的错误，所获得的显着性P值用25的FDR方 法转换为校正的q值。具有相关q〈〇. 001 (FDR 0.1%)的探针集被认为样本组之间显示出 显著的差异表达。数据可视化：基因表达的热图，是将RMA处理的微阵列基因表达数据的相 关子集导入到Java树形（Java Treeview)数据可视化包中，从而创建的。在一个基因是通 过在阵列上的多个探针集所代表的情况下，根据对所有样品的最高平均表达（即不考虑组 中成员的最可靠的样品杂交）选择单个探针集在热图中代表基因的表达。所描述的原始微 阵列数据已经上载到ArrayExpress库（EBI)中。
[0218]酶联免痔吸附试骀（ELISA)。
[0219] 在诱导胰腺特化的培养条件下生长了 18天的hESC，在葡萄糖刺激之前先在无胰 岛素的分化培养基中培养24小时。然后将细胞在PBS中洗涤三次，并在添加有2. 2mM葡萄 糖的DMEM(Invitrogen公司）中在37°C下预孵育60分钟。为了评估葡萄糖诱导的胰岛素 分泌，预孵育的细胞在含有22mM葡萄糖或可替代地2. 2mM葡萄糖的DMEM中生长15或60 分钟。收集上清液用于测定C肽的释放。ELISA分析如下进行。高结合表面C0STAR 96孔 板（Corning公司，纽约，USA)用亲和纯化的抗a 1-抗胰蛋白酶兔多克隆抗体（Abeam公司 31657,剑桥，英国）和抗白蛋白兔多克隆抗体（Abeam公司87564,剑桥，英国）以2μg/ml 的浓度在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（Na 2C03/NAHC03，PH值9. 5)中包被过夜。洗涤（0.9%w/ v的氯化钠，0. 05% v/v的吐温20)后，将板在封闭缓冲液（PBS，0. 25% w/v的BSA，0. 05% v/v的吐温20)中封闭2小时。培养基用封闭缓冲液稀释并在每孔中各加入50 yL，然后孵 育2小时。洗涤后，各孔用相应的单克隆抗体（lμg/ml稀释在封闭缓冲液中）孵育，孵育2 小时。结合的单克隆抗体用兔抗-小鼠IgG HRP-标记的抗体（Sigma Aldrich公司，黑弗 里尔，英国，1 :20, 000)检测1小时。该反应用TMB液体底物（Sigma Aldrich公司，黑弗里 尔，英国）在黑暗中显影10分钟，且用1M的H2S0j#止反应。用Thermo-max酶标仪（分子 仪器公司，桑尼维尔，加州，美国）在450nm处读取吸光度。
[0220] 免痔染色
[0221] 将hESC或它们的分化祖细胞在4 °C下在4%的多聚甲醛中固定20分钟，然后用 PBS洗涤三次。细胞在室温下在含有10%驴血清（Serotec公司）的PBST(PBS中含0. 1% 的Triton X100 ;西格玛公司）中孵育20分钟，随后在4°C下用一抗（表11)孵育过夜，该 一抗用含1 %驴血清的PBST稀释。然后将细胞用PBS洗涤三次，并在室温下用溶于含1 % 驴血清的PBST中的二抗（表11)孵育2小时。未结合的二抗用三次5分钟的PBS洗涤除 去。在第一次洗绦中加入Hoechst 33258 (Sigm-Aldrich公司；1 :10, 000)。为了使脂质可 视，采用一种脂质特异性染料B0DIPY(硼二吡咯亚甲基；BODIPY? 493/503 Invitrogen 公司.D-3922)。
[0222] 流式细朐术
[0223] 在胰腺分化方法的特定阶段的贴壁细胞用PBS洗涤两次，然后在37°C下再在细胞 解离缓冲液（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加州）中孵育20分钟。细胞通过轻柔的移液进 行分离并以每毫升约〇. 1-1X105个细胞密度在含有0. 1%叠氮化物（Serotec有限公司，牛 津，英国）的PBST+3%正常驴血清（NDS)中重悬。然后将细胞在4°C下在4%的多聚甲醛中 固定20分钟，然后在PBS中洗涤三次。细胞沉淀并重悬于2毫升的SAP缓冲液（含0. 1% (w/v)皂苷的Hanks平衡盐溶液）中。细胞在室温下用溶于SAP缓冲液的一抗（表11)孵 育2小时。然后将细胞用PBS+3% NDS洗涤三次，然后用溶于SAP缓冲液的二抗（表11)在 室温下孵育2小时。未结合的二抗用PBS洗涤三次除去。然后用FACS Calibur流式细胞 仪（BD生命科学公司，圣何塞，加利福尼亚州，美国）对细胞进行分析。将三次独立实验的 平均值记录为阳性细胞的数目。
[0224] MM.
[0225]在视昔酸的存在下的激活素和BMP信号传导的抑制在由hESC衍化而来并牛长在 完全确宙的培养备件下的内杯层细朐中诱导PDX1的表汰。
[0226] 我们最近建立了一个确定的培养体系，以将hESC和hIPSC分化为定形内胚层（DE) 细胞的近同质群（near homogenous populations) (Teo AK 等人?（2011)遗传和发育 25 : 238-250)。重要的是，该培养系统依赖不含动物产品的化学成分确定的培养基（CDM)，所述 动物产品包括牛血清白蛋白（BSA)、血清、复杂的细胞外基质（如Matrigel?或饲养细胞）； 因此避免了可能干扰试验结果的未知因素的存在。为了进一步延伸本方法，我们筛选了众 多生长因子和信号传导通路抑制剂的组合，以确定驱使DE细胞分化成胰腺祖细胞的培养 条件。这些分析显示：RA、FGF10、头蛋白（BMP抑制剂）和SB431542(激活素/TGF0受体拮 抗剂）的组合能够在由hESC衍化而来的DE细胞中诱导胰腺标志物roXl、HNF6、PTFlA、Sox9 和HLXB9的表达，同时抑制肠道（CDX2)和肝标志物（AFP)的表达（图2)。重要的是，这种 因子的混合物仅在特定基础培养基（高级DMEM)中诱导H)X1，而血清、Matrigel?或饲养物 的存在抑制胰腺祖细胞分化证实了 DE分化可以受多种因素影响。然后我们试图验证并优 化这些添加剂中每一个的作用。缺少RA而存在头蛋白、FGF10和SB431542(SB)抑制胰腺 标志物的表达（图2)证实了 RA对诱导胰腺特异性分化是必需的（Mfopou JK等人（2010) 胃肠病学138 :2233-2245,2245 e2231-2214)。缺少头蛋白或在分化过程中的任何时间添 加BMP4(图2)导致胰腺祖细胞标志物表达的显著下降，而诱导了肠道（⑶X2)和肝标志物 (AFP)，从而巩固了先前的研宄结果，显示BMP信号传导抑制了胰腺特化从而促进了另外的 细胞命运（Cai J等人（2010)分子细胞生物学杂志2 :50-60)。使用SU5402(FGF受体拮抗 剂）抑制FGF信号传导或增加FGF2/7/10的剂量不影响胰腺祖细胞标志物如H)X1、S0X9和 HLXB9的表达（图2)。然而，不存在FGF信号传导时，肠道标志物⑶X2的表达（Wells等人 (2000)发育127 :1563-1572)是增加的，而PTF1A的表达是大大减少的，表明在胰芽特异性 分化的过程中，FGF10能阻断roxi表达细胞向十二指肠的特异性分化（Wells等人（2000)， Spence等人（2011)自然470:105-109)。此外，FGF抑制引起大量细胞死亡暗示着FGFs对 胰腺祖细胞的体外增殖和存活也是必要的。更重要的是，我们观察到添加激活素消除了胰 腺标志物的表达，而用SB抑制激活素/TGF 0信号传导有相反的效果（图2)，这首次表明激 活素/TGF0信号传导会抑制体外胰腺特异性分化。
[0227] 有趣的是，仅在分化的前3天需要SB存在，这表明激活素/TGF0信号传导对H)X1 表达前的胰腺特异性分化的最早步骤起作用。这些结果一起表明，RA充当一个驱使DE细 胞向胰腺细胞系分化的诱导信号，而TGF0信号传导途径（即激活素+BMP)则作为本细胞 命运选择的有效抑制剂。
[0228]发育的自然涂径之后的激活素/TGF P的抑制诱导内杯层分化成腠腺祖细朐的沂 同质群
[0229] 根据上述结果，我们建立了 4步法用确定的培养基使hESC分化成胰腺祖细胞 (Def-Panc，图1)。在第一步（第1-3天）中，hESC生长在添加有激活素/BMP/FGF2/ LY294002 (PI 3-K抑制剂）（Teo等人（2011))的CDM中。由此产生的细胞的DE标志物包括 S0X17、CXCR4、HEX、F0XA2和E0MES的表达为阳性，而同时多能标志物0CT-4、NAN0G和S0X2 以及原条标志物T (Brachyury)和Mixll的表达为阴性（图3)。Def-Panc方法的第二步包 括在RA/头蛋白/FGF10/SB431542的存在下让DE细胞生长3天（第4-6天）。所得细胞表 达HNF1 0、F0XA2、HNF4、RFX6和HLXB9 (图4)，所有这些都标志着早期哺乳动物发育过程中 的前肠（图3)。值得注意的是，HLXB9的表达以及HEX表达的缺失提供了这些前肠细胞的背 侧同一性的指示，而CDX2的缺失排除了中肠或尾肠细胞的存在（图3)。在方法的第三步， 背侧前肠细胞在RA/头蛋白/FGF10/环巴胺存在的情况下再生长3天（第7-9天）。所得 的细胞表达前肠标志物（HNF10、S0X2、F0XA2和HLXB9)和胰腺祖细胞标志物（S0X9、HNF6、 PTF1A和H)X1)的组合（图3)。在方法的第四步中，通过加入FGF10培养3天（第10-12 天），胰腺祖细胞标志物的表达被进一步加强。得到的细胞表达NKX6. 1、S0X9、HNF6、PTF1A、 PDX1、HNF1 0、Sox2和F0XA2,而HLXB9的表达则急剧减少（图3)。第一步最后的FACS分 析显示，DE富集细胞的CXCR4呈现同质化的阳性，在方法的第四步后（第12天）80%的细 胞表达TOX1 (图4)。免疫染色分析证实，PDX1与S0X9、HNF6、HNF4、NKX6. 1和GATA4在相 同细胞中共表达。这些结果一起表明，Def-Panc方法驱使hESC在特异性分化的连续事件 后向胰腺祖细胞的近同质群分化，使人联想到那些在胰腺发育过程中发生的事情。
[0230]在确宙的培养备件下产牛的PDX1的内杯层可以在体外和体内分化成腠岛素分泌 细胞。
[0231] 为证实胰腺祖细胞进一步向内分泌细胞系分化的能力，将阶段4结束时获得的 H)X1表达细胞在先前已显示出能刺激内分泌细胞分化的培养条件下（Kroon E等人（2008 年）自然生物技术26:443-452)再生长6天。Q-PCR分析表明，在3天后，PDX1表达降低而 NGN3和激素标志物（胰岛素、胰高血糖素和促生长素抑制素）的表达逐渐增加（图3)。到 第18天，10%的染色细胞呈C-肽阳性。
[0232] 有趣的是，这些由hESC衍化而来的胰岛素表达细胞能够在葡萄糖刺激模拟0细 胞胰岛素释放时释放C-肽（图5)。尽管如此，当与人成年胰岛细胞相比时，激素标志物（胰 岛素、SST和GSC)的表达相对较低，而胰腺内分泌特异性标志物的表达维持（NKX6. 1、NGN3 和 Sox9)。
[0233] 此外，一小部分C-肽表达细胞也被发现是胰高血糖素或促生长素抑制素阳性的 (聚激素（poly-hormonal)表达可能标志着胚胎来源的|3细胞（Polak M等人（2000)糖 尿病49 :225-232)，由此确认我们的体外培养条件不足以产生完全功能的内分泌细胞。为 了克服体外系统中的这种局限，分化12天后的胰腺祖细胞被注射至N0D-SCID小鼠的肾囊 下，以提供一个已知的有利于它们分化成内分泌细胞环境（Kroon E等人（2008)自然生物 技术26 :443-452)。移植后12周一到，8个移植动物中的3个的血流中就检测出了低水平 的C-肽（阴性对照=0? 021ng/ml ;小鼠1 = 0? lng/ml，小鼠2 = 0? 43ng/ml，以及小鼠3 =0. 1635ng/ml)中。此外，移植了胰腺祖细胞的小鼠，在体内分化20周之后进行的肾囊中 的胰腺标志物的组织学分析揭示胰岛的存在看起来像表达胰高血糖素和C-肽细胞的细胞 簇。
[0234] 总之，这些结果表明，用Def-Panc方法生成的胰腺祖细胞具有进一步分化成内分 泌细胞的能力，因此代表着早期胰腺祖细胞。最后，3个hIPSC细胞系也获得了类似的结果， 表明该Def-Panc方法可成功地用于从不同的hPSC生成胰腺祖细胞。
[0235]激活素/TGFP驱伸内杯层细朐分化成可以分化为胎肝细朐的肝祖细朐
[0236] 在上述的培养条件的筛选中，我们注意到，在激活素存在下生长的DE细胞获得了 具有大的暗色胞质空间和小管样结构的胎肝细胞的外观。进一步的分析证实，在激活素的 存在下生长5天的DE细胞表达标志着腹侧前肠的基因，腹侧前肠是肝芽形成的位点（图7 中的册父、5(?17、11即4、？(^1、？(^2、了8乂3)。相反，由58引起的激活素抑制降低了11即4€[、 S0X17、HEX和TBX3的表达，同时阻止了已知肝诱导剂如FGF信号传导，也降低了肝芽基因如 HEX、S0X17和TBX3的表达（图8)。出人意料的是，头蛋白只诱导HNF4表达的适度减少，提 供了 BMP信号传导可能在体外肝特异性分化中具有有限的功能的暗示。可替代地，未知信 号传导途径可激活相同的分化程序。合在一起考虑，这些结果表明激活素、BMP和FGF的组 合效果对于充分促进DE细胞的体外肝特异性分化是必要的。
[0237] 基于该观察，我们开发了一个3步的方法，在确定的培养条件下从hPSC生成肝细 胞（Def-H印，图1)。Def-H印方法的第一步在于上文已经描述的hESC分化为DE细胞，第 二步涉及促进DE向着肝细胞系的特异性分化，先采用单独的激活素3天，然后用激活素与 BMP4和FGF10的结合。在Def-Hep方法的第三步中，肝内胚层细胞在制瘤素M和HGF、控制 成肝细胞分化为肝细胞的两个已知的生长因子的存在下另外再生长15天。
[0238] 因此，利用Def-H印方法生成的细胞表达肝标志物，如白蛋白（ALB)、a-1-抗胰 蛋白酶仏41')、€^?0?、了41\了002、171?、11即4€[和册乂（图9)。这些观察结果被免疫染色和 FACS分析所证实，这显示了 ALB、细胞角蛋白18、AAT和AFP的同质共表达（图10)。这些 细胞还显示了肝细胞的功能特性，如：（i )ALB和AAT分泌（图11)，（ ii )地塞米松可诱 导的Cyp3A4活性（图12)，（ iii)胆固醇摄取（如DIL试验所示）和（iv )糖原贮积（如 PAS染色所示）。总之，这些数据表明，激活素驱使DE向类VF细胞特异性分化，然后向肝内 胚层特异性分化，肝内胚层具有分化成显示出胎肝细胞特征的细胞的能力。
[0239]hESC的腠腺和肝