中培养 细胞。合适的方法和培养基在W02008/056166中有描述。内胚层诱导培养基可以由化学 成分确定的基础培养基，如CDM-PVA或高级DMEM，添加TGF0配体，优选为激活素，（例如 5~25ng/ml，优选为10ng/ml左右），FGF2(例如5~25ng/ml，优选为20ng/ml左右）， BMP-4 (例如在5~20ng/ml，优选为10ng/ml左右），一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，优选 LY294002 (例如 5-30 y M，优选为 5-10 y M)组成。
[0083] 多能细胞群可以在内胚层诱导培养基中培养2至4天，最优选为3天，以产生定形 内胚层细胞的细胞群。
[0084] 在一些【具体实施方式】中，一个三步步骤方法可以用于诱导多能细胞分化成定形内 胚层（DE)细胞，该多能细胞例如iPS细胞。该方法可以包括先在含有GSK3 0抑制剂的内 胚层诱导培养基中培养细胞，然后在不含GSK3 0抑制剂的内胚层诱导培养基中培养细胞， 随后在ADE诱导培养基中培养。合适的方法和培养基在W02012/025725中有描述。例如， 多能细胞群分化为DE细胞可以包括；
[0085] (a)在一种上文所述的内胚层诱导培养基中培养多能细胞群，所述培养基内添加 有一种糖原合成酶激酶3 0抑制剂，优选为CHIR99021 ;
[0086] (b)进一步在不含糖原合成酶激酶3 0抑制剂的内胚层诱导培养基中培养上述细 胞群，以及
[0087] (c)进一步在含有TGF0配体和成纤维细胞生长因子活性的ADE诱导培养基中培 养上述细胞群以生成定形内胚层（DE)细胞的细胞群。
[0088] 所述细胞可以在每种培养基中孵育如12-36小时，优选为24小时左右。
[0089] 所述糖原合成酶激酶3 0抑制剂可以以浓度为0. 3-30 yM，优选为3 yM左右的浓 度存在于步骤（a)的所述培养基中。
[0090]所述前定形内胚层（ADE)诱导培养基可以是一种化学成分确定的培养基（CDM)， 它包括一种TGF0配体，优选为激活素，和成纤维细胞生长因子（FGF)。在一些具体实施方 式中，这些可能是所述培养基中仅有的分化因子。
[0091] 例如，一种合适的ADE培养基可以由一种化学成分确定的基础培养基，例如 RPMI-1640;-种TGF0配体，优选为激活素，（例如，10~250ng/ml，优选为100ng/ml左 右）；和FGF，如FGF2 (例如5~500ng/ml，优选为40ng/ml左右）组成。所述化学成分确 定的基础培养基可添加有一种无血清培养基添加物，如B27或NS21。
[0092] 定形内胚层细胞的细胞群可表达内胚层标志物，如S0X17、CXCR4和GSC，并且可能 会缺乏多能标志物或与外胚层或中胚层细胞系相关的标志物的表达。例如定形内胚层细胞 可能不表达可检测水平的以下一种或多种，优选为全部；0ct4、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、 Nanog、SSEA-4、TRA-1-60 和 KLF-4。
[0093] 所述定形内胚层细胞的细胞群在一系列的胰腺诱导培养基中培养以诱导分化成 胰腺祖细胞。
[0094] 采用第一胰诱导培养基来诱导定形内胚层细胞分化为背侧前肠细胞。
[0095]第一胰诱导培养基是化学成分确定的培养基（CDM)，它包括激活素/TGF- 0拮抗 剂；FGF ;视黄酸；和BMP拮抗剂。在一些【具体实施方式】中，这些可能是所述培养基中仅有的 分化因子。
[0096] 例如，该第一胰诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM，添加 有一种激活素/TGF-0拮抗剂，优选为SB-431542 (例如，5-25 yM，优选为10 yM左右）， FGF，优选为FGF10 (例如5-100ng/ml，优选为50ng/mL左右），视黄酸（例如0? 5-20 y M，优 选为2yM左右）以及一种BMP拮抗剂，优选为头蛋白（例如100-500ng/ml)组成。
[0097] 优选地，定形内胚层细胞的细胞群可以培养2至4天，最优选为3天，以生成背侧 前肠细胞的细胞群。
[0098] 背前肠细胞的细胞群可表达标记物；Hex、RFX6、F0XA2、HNFlb、S0X2、HNF4a和 HLXB9。背前肠细胞可能会缺乏与较低分化程度的细胞相关的标记物的表达，如S0X17、 CXCR4 和 GSC。
[0099] 采用第二和第三胰诱导培养基来诱导背侧前肠细胞分化称为胰祖细胞。
[0100] 第二胰诱导培养基是化学成分确定的培养基（CDM)，它包括FGF、BMP抑制剂、视黄 酸和hedgehog信号传导抑制剂。在一些【具体实施方式】中，这些可能是所述培养基中仅有的 分化因子。
[0101] 例如，该第二胰诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM，添 加有一种FGF，优选为FGF10 (例如5-100ng/ml，优选为50ng/mL左右）；视黄酸（例如 0. 5-20yM，优选为2yM左右）；hedgehog信号传导抑制剂，优选为KAAD-环巴胺（例如 0.1-lyM，优选为0.25yM左右）；以及一种BMP拮抗剂，优选为头蛋白（例如5-500ng/ml 或100_500ng/ml，优选为50ng/ml左右）组成。
[0102] 所述背侧前肠细胞可以在第二胰诱导培养基中培养2到4天，最优选3天。
[0103] 在第二胰诱导培养基培养后，分化中的细胞可以是在第三胰诱导培养基中培养。
[0104] 该第三胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基（CDM)，它含有FGF。在一些具 体实施方式中，FGF和可选的视黄酸可以是培养基中的仅有的分化因子。
[0105] 例如，所述第三胰诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM，添 加有一种FGF，优选为FGF10或FGF7 (KGF)(例如5-100ng/ml，优选为50ng/mL左右）。在一 些优选的【具体实施方式】中，化学成分确定的基础培养基可进一步添加有视黄酸。
[0106] 细胞可以在第三胰诱导培养基中培养2到4天，最优选3天，以生成胰祖细胞的细 胞群。
[0107] 胰腺祖细胞的细胞群可能表达标志物H)X1、S0X9、HNF6、NKX6. 1和PTFla。胰祖细 胞可能会缺乏与较低分化程度的细胞相关的标记物的表达，如HLXB9。
[0108] 在一些【具体实施方式】中，所述胰腺祖细胞可以是进一步分化和/或成熟，以生成 胰腺内分泌细胞的细胞群。用于胰腺内分泌细胞的成熟的合适的方法是在本领域可获得的 (参见Kroon E等人（2008)自然生物技术26:443-452)。例如，胰腺祖细胞可以在第一内 分泌诱导和第二内分泌诱导中进行培养。
[0109]该第一内分泌诱导培养基是一种化学成分确定的培养基（CDM)，它含有Notch信 号传导抑制剂。在一些【具体实施方式】中，所述第一内分泌诱导培养基可进一步包含视黄酸。 在一些【具体实施方式】中，Notch信号抑制剂和可选的视黄酸，可以是培养基中的仅有的分化 因子。除Notch信号传导抑制剂和可选的视黄酸以外，所述第一内分泌诱导培养基可包含 一种基础培养基，优选为高级DMEM，添加有一种无血清培养基补充物，优选为B27。
[0110] 例如，该第一内分泌诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM， 添加有B27和Notch信号传导抑制剂，优选为DAPT (例如0. 1-lOmM，优选为ImM左右）。在 一些【具体实施方式】中，第一内分泌诱导培养基可进一步包含视黄酸。
[0111] 合适的无血清培养基补充物包括B27 (Brewer等人脑研宄（1989)49465-74 ; Brewer等人神经科学研宄杂志35 567-576(1993) ;Brewer等人焦点1616-9 ;Brewer等 人（1995)神经科学研宄杂志.42 :674-683 ;Roth等人微量元素医学生物学杂志（2010)24 130-137)和NS21 (Chen等人神经科学方法杂志（2008) 171 239-247)。无血清培养基补充 物，如B27和N21，是本领域所公知的并可广泛地从商业渠道购买（例如，Invitrogen公司； Sigma Aldrich 公司）。
[0112] 胰腺祖细胞可以在第一内分泌诱导培养基中培养2到4天，最优选3天。
[0113] 第二内分泌诱导培养基可以是没有额外分化因子或者可以包括视黄酸的化学成 分确定的培养基（CDM)。第二内分泌诱导培养基可包含一种基础培养基，优选为高级DMEM， 添加有一种无血清培养基补充物，优选为B27。在一些【具体实施方式】中，第二内分泌诱导培 养基可进一步包含视黄酸。
[0114] 胰腺祖细胞可以在第二内分泌诱导培养基中培养2到4天，最优选3天。
[0115] 胰腺内分泌细胞的细胞群可能表达标记物NGN3、INS、SST和GLU。
[0116] 优选地，胰腺内分泌细胞的细胞群可以经葡萄糖刺激分泌胰岛素。
[0117] 胰腺内分泌细胞可能缺乏分化程度较低的胰腺或内胚层细胞特征标记物的表达， 如 PDX1、S0X9、HNF6、NKX6. 1 和 PTFla。
[0118] 哺乳动物细胞的培养是本领域公知的技术（参见，例如，基础细胞培养技术， C.Helgason，Humana出版公司美国（2004年10月15日）ISBN:1588295451 ;人细胞培养技 术（分子医学中的方法S.) Humana出版公司，美国（2004年12月9日）ISBN : 1588292223 ;动 物细胞培养：基础技术手册，R. Freshney，John Wiley&Sons公司（2005年8月2日），ISBN : 0471453293, Ho WY等人免疫学方法杂志（2006)310 :40-52,干细胞手册（编辑R. Lanza) ISBN:0124366430)。培养基和其中的成分可从商业渠道（如Gibco公司、罗氏公司、Sigma 公司、欧洲生物制品公司、研发系统公司）获得。上述培养步骤中可以采用标准的哺乳动物 细胞培养条件，例如37°C、21 %的氧气、5%的二氧化碳。培养基优选为每两天换一次且允许 细胞由于重力影响而沉淀。
[0119] 在培养基中培养之后，所述群可以包含80%或更多、85%或更多、90%或更多、或 95%或更多的胰腺祖细胞或，如果成熟的话，胰腺内分泌细胞。
[0120] 在一些【具体实施方式】中，所述胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可 以是基本上不含其它细胞类型的，以使其不需要进一步纯化。例如，该群可以是同质或基本 上同质的。
[0121] 在本文所述方法的任何阶段产生的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以是被分离 和/或纯化的。
[0122] 细胞群中的胰腺祖细胞或内分泌细胞可以使用本领域技术人员所公知的任何技 术同其他类型的细胞分离，上述本领域技术人员所公知的任何技术包括那些基于依靠抗体 和磁珠或荧光激活细胞分选（MACS或FACS)的细胞外表位识别的技术，包括使用上文所述 的抗特征标记物胞外区域的抗体。
[0123] 如本文所述生成的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以使用标 准的哺乳动物细胞培养技术被扩大、繁殖或维持。
[0124] 在一些【具体实施方式】中，胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以生 长或维持在三维（3D)培养系统中。合适的3D系统是本领域已知的并且可从商业供应商 (例如Sigma-Aldrich公司）处获得的，合适的3D系统例如合成或天然聚合物支架。
[0125] 细胞群中胰腺祖细胞或内分泌细胞执行一个或多个胰腺细胞功能的能力可以被 监测和/或检测。例如，细胞执行一个或多个以下功能；胰岛素表达、胰岛素分泌、葡萄糖响 应和移植到动物模型中的能力，可以被监测和/或检测。
[0126] 用于确定胰腺细胞功能的合适的方法是本领域所公知的。
[0127] 在一些【具体实施方式】中，如本文所述生成的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细 胞的细胞群可以被存储，例如通过冷冻干燥和/或冷冻保存存储。
[0128] 本发明的另一个方面提供了一个通过如上所述的方法生成的分离的胰腺祖细胞 的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群。
[0129] 该群可以包含80 %或更多、85 %或更多、90 %或更多、或95 %或更多的胰腺祖细 胞或胰腺内分泌细胞。
[0130] 该细胞可以是临床级细胞，其没有被暴露于不确定的培养基成分或其它潜在的污 染物中过。
[0131] 该细胞可以显示出一个或多个成熟胰腺细胞的功能或功能性特征，或者可以是在 植入或移植到哺乳动物宿主内后，能够显示出一个或多个这样的功能或功能性特征。例如， 没有植入哺乳动物宿主或者植入哺乳动物宿主之后，所述细胞能够显示出胰岛素表达；胰 岛素分泌；和葡萄糖响应中的一个或多个。
[0132] 胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以在治疗方法中使用，例如可 用于具有胰腺症状，如糖尿病的患者的治疗中。细胞群可以在用于治疗胰腺症状，例如糖尿 病药物的制造中使用。
[0133] 在一些【具体实施方式】中，被施用于个体的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以被基 因操纵以产生治疗分子，例如一种药物或生长因子（Behrstock等人，基因治疗2006年3 月；13(5) :379-88，Klein SM 等人，人类基因治疗 2005 年 4 月；16(4) :509-21)。
[0134] 本发明的其他方面涉及在治疗中或在生产用于治疗的成熟胰腺细胞中，使用分离 的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群的方法。
[0135] 一种治疗胰腺病症的方法可以包括；
[0136] 对需要的个体施用一种如本文所述产生的分离的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内 分泌细胞的细胞群。
[0137] 适于治疗的胰腺病症可以包括遗传性和家族性胰腺炎和糖尿病病症，如I型和II 型糖尿病。
[0138] 所述胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以被移植、输注或以其它方式施用到个体的 胰腺。合适的技术是本领域众所周知的。
[0139] 用于治疗方法的细胞可以配制成治疗组合物。
[0140] 本发明延伸到一种治疗组合物、药物或其他组合物，该其他组合物包括如本文所 述生成的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞，一种包括给患者施用这种胰腺祖细胞或胰腺内分 泌细胞的方法，例如用于治疗（可包括预防性治疗）如上所述的一种胰腺病症，以及制备一 种治疗组合物的方法，该治疗组合物包括将这种胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞或胰腺内分 泌细胞与治疗上可接受的赋形剂、媒介物或载体，以及可选的一种或多种其它成分混合。
[0141]根据本发明的一种治疗组合物，以及符合本发明的使用方法的一种治疗组合物， 除了细胞以外，还可包括药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂或 其它本领域技术人员公知的材料。这样的材料应该是无毒的，并且不应干扰细胞的活性。所 述载体或其它材料的精确性质将取决于给药的途径。
[0142]液体治疗组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成 油。生理盐水溶液、组织或细胞培养基、右旋糖或其它糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或 聚乙二醇可被包括在内。
[0143]所述组合物可以是以肠胃外可接受的水溶液形式，其是无热原的并且具有合适的 pH、等渗性和稳定性。那些本领域的相关技术人员完全能够制备合适的溶液，例如采用等渗 载体，如氯化钠、林格氏注射液，或乳酸林格氏注射液。组合物可使用人造脑脊液制备。
[0144]胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以通过本领域已知的任何技术植入或注入到患 者体内（例如Lindvall，0. (1998)运动障碍性疾病.13,增刊1 :83-7 ;Freed，C. R.等人； (1997)细胞移植，6, 201-202 ;Kordower，等人，（1995)新英格兰医学杂志，332, 1118-112