0 yMl-硫代甘油。在一些优选的【具体实施方式】 中，CDM-PVA可以在本文所述的内胚层诱导培养基中使用。
[0043] 其它合适的化学成分确定的基础培养基包括RPMI_1640(Moore，G.E.和Woods L.K.，（1976年）组织培养协会手册.3,503-508)。在一些优选的【具体实施方式】中， RPMI-1640可以使用在本文所述的前定形内胚层诱导培养基中。
[0044] 其它合适的化学成分确定的基础培养基是本领域已知的并且可从商业来源（例 如，Sigma-Aldrich公司，密西根，美国；生命科技公司，美国）获得。
[0045] 如本文所述的合适的化学成分确定的基础培养基可以包括无血清培养基添加物 (即含有添加物的基础培养基）。合适的无血清培养基添加物包括B27和NS21并且如本文 其它地方所描述的。优选地，本文所述的培养基是无血清的。使用无血清条件和无动物产 品有助于临床应用的扩大培养。
[0046] 化学成分确定的基础培养基，如CDM/PVA、RPMI-1640或高级DMEM，可以添加一组 特定的分化因子以制成内胚层或胰诱导培养基，或如本文所述的内分泌诱导。
[0047] 分化因子是调节信号传导通路的因子，信号传导通路介导哺乳动物细胞的分化， 前述调节如促进或抑制。分化因子可包括生长因子和抑制剂，其调节一个或多个激活素/ Nodal、FGF、Wnt或BMP信号传导通路。分化因子是蛋白质，优选为重组人的因子。
[0048] 分化因子的实例包括FGF2、BMP4、视黄酸、TGF、⑶F3、LIF、IL、激活素和磷脂酰肌 醇3-激酶（PI3K)抑制剂。
[0049] 在一种或多种本文所述的培养基中使用的分化因子包括TGF0配体、成纤维细胞 生长因子（FGF)、骨形态发生蛋白（BMP)、PI3K抑制剂、激活素/TGF0拮抗剂；视黄酸；BMP 诘抗剂；hedgehog信号传导抑制剂；notch信号传导抑制剂和GSK3 |3抑制剂。
[0050] TGF 0配体是TGF 0超家族的肽，在哺乳动物细胞内刺激SMAD2和SMAD3介导的细 胞内信号传导通路。TGF0超家族的成员具有一个特征结构，并且是本领域中众所周知的。
[0051] 该TGF0配体可以是激活素、TGF0、Nodal或⑶F3,优选为激活素。
[0052]激活素（激活素 A :NCBIGenelD:3624 核酸参考序列 NM_002192. 2GI :62953137， 氨基酸参考序列NP_002183. 1GI :4504699)是二聚体多肽，其通过刺激激活素/Nodal通路 发挥一系列的细胞效应（Vallier等人，细胞科学118:4495-4509(2005))。激活素是容易 从商业来源获得的（例如Stemgent公司，马萨诸塞州，美国）。在本文中所描述的培养基中 激活素适宜的浓度可以是10~l〇〇〇ng/ml，优选为100ng/ml左右。
[0053] TGF0 (NCBI GenelD :7040 核酸参考序列 NM_000660. 4GI :260655621，氨基酸参考 序列NP_000651. 3GI :63025222)是一种同二聚体多肽，其调节增殖和分化（Watabe，T.等人 (2009) ?细胞研宄? 19 :103-115)。重组人TGF0是容易从商业来源获得的（例如Stemgent 公司，马萨诸塞州，美国）。培养基中TGF0适宜的浓度可以是10~1000ng/ml，优选为 100ng/ml 左右。
[0054] Nodal (NCBI GenelD 4838 核酸序列参考 NM_018055.4GI :222352097,氨基酸序列 参考NP_060525. 3GI :222352098)是TGF0超家族中的一员，其调节分化（Hamada等人自然 综述遗传学.3(2) : 103-13)。Nodal是容易从商业来源获得的（例如Abeam有限公司，英 国）。培养基中TGF0适宜的浓度可以是10~1000ng/ml，优选为100ng/ml左右。
[0055]⑶F3(NCBIGenelD9573核酸序列参考 NM_020634. 1GI:10190669,氨基酸序列参 考NP_065685. 1GI:10190670)是TGF0超家族的一员，它的特点具有多元蛋白酶解加工位 点，该位点被切割生成含有7个保守半胱氨酸残基的成熟GDF3蛋白。培养基中GDF3适宜 的浓度可以是10~l〇〇〇ng/ml，优选为100ng/ml左右。
[0056] 成纤维细胞生长因子是一种其通过结合到成纤维细胞生长因子受体（FGFR)刺激 细胞生长、增殖和细胞分化的蛋白因子。适合的成纤维细胞生长因子包括FGF家族的任何 成员，例如FGF1至FGF14以及FGF15至FGF23中的任意一个。
[0057] 优选地，所述成纤维细胞生长因子是FGF2 (NCBI GenelD :2247,核酸序列 NM_002006. 3GI :41352694,氨基酸序列 NP_001997. 4GI :41352695) ;FGF7(也称为角质化 细胞生长因子（或 KGF)，NCBI GenelD: 2247,核酸序列 NM_002006.3GI :41352694,氨基酸 序列即_001997.461:41352695);或？6?10(从^1661^10:2247，核酸序列匪_002006.361 : 41352694,氨基酸序列NP_001997. 4GI :41352695)。最优选地，所述成纤维细胞生长因子是 FGF10(Amit，M.等人，发育生物学227:271-278 (2000))。在本文中所描述的培养基中FGF 适宜的浓度可以是1~500ng/ml，例如10~150ng/ml、10~50ng/ml或5~25ng/ml，优 选为20ng/ml左右。
[0058] 成纤维细胞生长因子，如FGF2、FGF7和FGF10,可以用常规重组技术来制备，或从 商业供应商（例如，研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州；Stemgent公司，美国）处获 得。
[0059] 在一些【具体实施方式】中，FGF可以被表皮生长因子（EGF ;NCBI GenelD : 1950,核酸 序列 NM_001178130. 1GI :296011012,氨基酸序列 NP_001171601. 1GI :296011013)。表皮生 长因子是一种通过结合至一表皮生长因子受体（EGFR)刺激细胞生长、增殖和细胞分化的 蛋白因子。EGF可以用常规重组技术来制备或从商业供应商（例如，研发系统公司，明尼阿 波利斯，明尼苏达州；Stemgent公司，美国）处获得。
[0060] 骨形态发生蛋白（BMP)骨形态发生蛋白与骨形态发生蛋白受体（BMPR)结合，并通 过由SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的通路刺激细胞内信号传导。合适的骨形态发生蛋白包括 BMP家庭的任何成员，例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6或BMP7。优选地，第二TGF 0配体是 BMP2 (NCBI GenelD :650,核酸序列 NM_001200. 2GI :80861484 ;氨基酸序列 NP_001191. 1GI : 4557369)或 BMP4(NCBI GenelD :652,核酸序列 NM_001202. 3GI :157276592 ;氨基酸序列 NP_001193. 2GI:157276593)。合适的骨形态发生蛋白包括BMP4。在本文所描述的培养基 中骨形态发生蛋白适宜的浓度，可以是1~500ng/ml，优选为10ng/ml左右，其中骨形态发 生蛋白例如BMP2或BMP4。
[0061] 骨形态发生蛋白可以用常规重组技术来制备或从商业供应商（例如，研发系统公 司，明尼阿波利斯，明尼苏达州；Stemgent公司，美国）处获得。
[0062] PI3K抑制剂抑制磷脂酰肌醇3-激酶，如磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸3-激酶 (EC2. L 1. I53)的活性。
[0063] 合适的PI3K抑制剂包括渥曼青霉素；LY301497 (17-b-羟基渥曼青霉素）； LY294002 (2-吗啉-4-基-8-苯基铬-4-酮：Maclean 等人（2007)干细胞 2529-38); CLB1309(KN309 :(±)-2-({1-[7-甲基 _2_(吗啉-4-基）-4_ 氧代-吡啶并[1，2-a] 嘧啶-9-基]乙基}氨基）苯甲酸）；PX-866 ((1E，4S，4aR，5R，6aS，9aR) -5-(乙酰氧 基）-1-[(双-2_丙烯-1-基氨基）亚甲基]-4, 4a，5, 6, 6a，8, 9, 9a-八氢-11-羟基-4-(甲 氧甲基）-4a，6a-二甲基环戊烷[5,6]萘并[1，2-C]吡喃_2,7, 10(1H)-三酮）；IC87114(喹 诺酮吡咯并嘧啶）；⑶C-0941(2-(1H-吲唑-4-基）-6-[[4-(甲基磺酰基）-1_哌嗪基]甲 基]-4-(4-吗啉基）-噻吩并[3,2-(1]嘧啶）汀6父-221(7-甲基-2-(4-吗啉基）-9-[1-(苯 基氨基）乙基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮），槲皮素；BEZ235 ;XL147 ;X1765 ;PX-866 ; 251￥474(2-(2-二氟甲基苯并咪唑-1-基）4,6-二吗啉基-1，3,5-三嗪）；和5?1126(2-〔 2-甲氧基乙氨基]-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮）。其它PI3K抑制剂是本领域中可获 得的。
[0064] 在一些优选的【具体实施方式】中，PI3K抑制剂是LY294002。
[0065] 合适的PI3K抑制剂可以从商业供应商（例如Calbiochem公司，加利福尼亚州，美 国）处获得。
[0066] 例如，一种培养基可含有1至lOOyM的PI3K抑制剂，如LY294002,优选10yM左 右。
[0067]激活素/TGF 0拮抗剂抑制激活素/Nodal信号传导并促进前肠细胞特化成胰腺， 而不是肝系。
[0068] 合适的激活素/TGF- 0拮抗剂包括SB431542 (4- (5-苯[1，3]二氧杂环戊 烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基）-苯甲酰胺水合物；Sigma，Tocris生命科学 公司，布里斯托尔，英国；（Inman等人分子药理学杂志（2002) 62165-74)，柚皮素（5, 7-二 羟基-2-(4-羟基苯基）苯并二氢吡喃-4-酮），SIS3 (6, 7-二甲氧基-2-((2E)-3-(1-甲 基-2-苯基-1H-吡咯[2, 3-b]吡啶-3-基-丙-2-烯酰基））-1，2, 3, 4-四氢异喹啉）， A83-01 (3-(6-甲基-2-吡啶基）-N-苯基-4-(4-喹啉基）-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺）和可 溶性蛋白因子，如 lefty (例如人类 lefty 2 :NP_003231. 2GI :27436881)，cerberus (如人 类 Cerberus 1 :NP_005445. 1GI :4885135)或卵泡抑素（follistatin)(如人类卵泡抑素： NP_006341. 1GI :5453652)。优选地，所述激活素 /TGF0 拮抗剂为 SB-431542。
[0069] 培养基中激活素/TGF0拮抗剂适宜的浓度可以是1~100 yM，优选为10 yM左 右。
[0070]视黄酸（（2E，4E，6E，8E) -3, 7-二甲基-9- (2, 6, 6-三甲基环己烯-1-基） 壬-2, 4, 6, 8-四烯酸）是一种维生素A的代谢物，其通过结合至视黄酸受体（RAR)调节转 录并调节一定范围内的细胞类型的分化。在本文中所描述的培养基中优选采用全反式视黄 酸。
[0071] 培养基中视黄酸适宜的浓度可以是1~10yM，优选为2yM左右。
[0072] 视黄酸可以从商业供应商（例如Sigma Aldrich公司，美国；Stemgent公司，美 国）处获得。
[0073] BMP拮抗剂在细胞中抑制BMP信号传导。各种BMP拮抗剂是本领域已知 的，包括LDN-193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基）苯基）吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基） 喹啉；Yu等人（2008)自然化学生物学433-41))、⑶F3、头蛋白（Noggin)、和 dorsomorphin( 6-[4-[2_(l-哌啶基）乙氧基]苯基]_3_(4-吡啶基）吡挫并[l， 5_a]喃 啶；Yu等人（2008)自然化学生物学433-41))。优选地BMP拮抗剂是头蛋白。
[0074] 培养基中BMP拮抗剂适宜的浓度可以是1~1000ng/ml，例如10~1000ng/ml，优 选为50ng/ml左右。
[0075] hedgehog 信号传导抑制剂通过 Sonic Hedgehog (SHH)和 Smoothened (SM0)介导 的hedgehog信号传导通路抑制信号传导。合适的hedgehog信号传导抑制剂是本领域众所 周知的，并且包括3-酮基-N-(氨基乙基-氨基己酰基-二氢化肉桂酰）环巴胺（KAAD-环 巴胺）、saridegib、vismodegib 和 erismodegib。优选地，所述 hedgehog 信号抑制剂是 KAAD-环巴胺。培养基中hedgehog信号传导抑制剂适宜的浓度可以是1~100ng/ml，优选 为50ng/ml左右。
[0076] Notch信号传导抑制剂抑制通过Notch信号传导途径抑制信号的通路，所述Notch 信号传导途径是由Notch受体介导的，前述Notch受体如哺乳动物细胞中的Notch-1至 Notch-4。合适的Notch信号传导抑制剂是本领域所熟知的，并且包括N-[N-(3, 5-双氟苯 乙酰基）-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT)。
[0077] 培养基中notch信号传导抑制剂适宜的浓度可以是1~10mM，优选为ImM左右。
[0078] GSK3 0抑制剂抑制糖原合成酶激酶3 0 (Gene ID 2932 :EC2. 7. 11. 26)的活性。适 合的抑制剂包括CHIR99021 (6- ((2- ((4- (2, 4-二氯苯基）-5- (4-甲基-1H-咪唑-2-基）嘧 啶-2-基）氨基）乙基）氨基）烟腈；Ring D.B.等人，糖尿病，52 :588-595(2003))阿斯特帕 罗酮（alsterpaullone)、坎帕罗酮（kenpaullone)、SB216763 (3- (2, 4-二氯苯基）_4_ (1-甲 基-111-吲哚-3-基）-111-吡咯-2,5-二酮）和38415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基）氨 基]-4- (2-硝基苯基）-1H-吡咯-2, 5-二酮）。例如，定形内胚层诱导培养基可含有0. 3至 30 y M的一种GSK3 0抑制剂，如CHIR99021，优选3 y M左右。
[0079] 合适的hedgehog信号传导传导抑制剂、notch信号传导抑制剂和GSK3 |3抑制剂 可从商业供应商（例如Stemgent公司，马萨诸塞州，美国；Cayman化学公司，密西根州，美 国）处获得。
[0080] 多能干细胞的细胞群在定形内胚层诱导培养基中培养以诱导分化成DE细胞。 hESC和人hIPSC分化成定形内胚层（DE)的邻近同质细胞群的合适方法的是本领域已知的 (Teo AK 等人（2011)基因与发育 25 :238-250 ;TO2008/056166 ;TO2012/025725)。
[0081] 内胚层诱导培养基可以是化学成分确定的培养基（CDM)，它包括一种TGF0配体， 优选为激活素、成纤维细胞生长因子（FGF)、骨形态发生蛋白（BMP)、一种PI3K抑制剂和可 选的一种糖原合成酶激酶3 0抑制剂，优选为CHIR99021。在一些【具体实施方式】中，这些可 能是所述培养基中仅有的分化因子。
[0082] 在一些【具体实施方式】中，一个单步步骤方法可以用于诱导多能细胞分化成定形内 胚层0)E)细胞，该多能细胞例如ES细胞。该方法可以包括在内胚层诱导培养基