一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种适应单细胞纯悬浮无血清培养的哺乳动物细胞系的驯化方法以 及使用该方法制备的细胞系。
【背景技术】
[0002] 哺乳动物细胞的培养经历了滚瓶-微载体的培养模式。培养模式的改进，不但更 容易实现规模化生产，而且降低了后期纯化工艺的难度。
[0003] 转瓶培养技术是传统的贴壁细胞培养方式，将细胞接种在旋转的圆筒形转瓶中， 细胞贴附于玻璃壁四周，培养过程中转瓶在轴承上不断旋转，使细胞能够交替接触培养液 和空气，实现细胞生长代谢的目的。
[0004] 滚瓶培养工艺不能对培养液组分、pH以及DO等条件实时控制调整，无法保证细胞 处于最佳的生长状态，不能实现工业的大规模生产；滚瓶培养工艺繁琐复杂，周期长，劳动 强度大，占地空间大，费时费力，且批次间差异较大，生产质量难以控制，产品质量不稳定。
[0005] 微载体培养技术成为目前大规模培养应用较多的一项工艺，常使用的载体有两 种，一种是片状载体，一种是球状载体。细胞在载体表面呈现单层生长，实现了在相当少的 空间生产高密度的细胞和细胞产物。
[0006] 微载体的价格昂贵，生产成本高，对动物疫苗生产不适合。而且微载体培养细胞过 程中需要添加一定量的血清，不利于流感病毒的增殖；血清添加产生的副作用较大，后期纯 化工艺困难。此外，培养基中添加了动物源血清使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污 染的风险大大提商，并且生广成本提商。
[0007] 流感病毒疫苗的制备经过了从动物组织器官到细胞培养的规模化发展过程，流感 病毒的培养经历了从鸡胚到哺乳动物细胞的发展过程，因此，基于以上考虑，开发出一种 适合流感病毒无血清纯悬浮培养制备流感疫苗工艺具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种适应单细胞纯悬浮无血清培养的哺乳 动物细胞系的驯化方法以及使用该方法制备的细胞系。
[0009] 本发明的主要目的在于提供一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法， 所述方法包括：（1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的所述哺乳动物细胞，用胰酶 消化；（2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养所述贴壁培养的哺乳动物细胞，连续 培育所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基；以及（3)重复步骤 (2)中的所述连续培育程序，逐渐降低所述无血清培养基中的血清添加量，直到所述无血清 培养基中血清添加量为〇,得到所述悬浮培养的哺乳动物细胞。
[0010] 优选地，所述步骤（1)中的哺乳动物为MDCK细胞。
[0011] 优选地，所述步骤（2)和（3)中的所述无血清培养基包括VP-SFMAGT?、MDCK细胞 无血清无蛋白化学培养基、InVitrus?、或SFM4MegaVir?培养基以及在所述步骤（3)中当 血清添加量为1%及以下时，所述无血清培养基还包括添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚 糖。
[0012] 优选地，所述步骤（2)中所述血清添加量为5% ;所述步骤（3)中所述逐渐降低的血 清添加量分别为3%、1%、0. 5%、0%。
[0013] 优选地，所述步骤（2)和（3)中的连续培养所述哺乳动物细胞至适应所述添加了 一定量血清的无血清培养基的程序为连续培养3~5代。
[0014] 本发明的另一目的在于提供所述方法制备的所述悬浮培养的哺乳动物细胞系。
[0015] 本发明的再一目的在于提供一种制备流感病毒疫苗的方法，所述方法包括，（1)用 所述无血清培养基扩增培养所述悬浮培养的哺乳动物细胞；（2)在所述步骤（1)中培养的 所述悬浮培养的哺乳动物细胞中接种所述流感病毒，扩增培养所述流感病毒；以及（3)收 获所述流感病毒，灭活。
[0016] 具体而言，复苏一支冻存的已经适应无血清悬浮培养的MDCK细胞，复苏方法为： 液氮中取出细胞一支，迅速放入37°C水浴锅中溶解。75%酒精擦拭后放入超净工作台，Iml 吸管吸出细胞轻轻加入15ml离心管中，然后加入IOml生长液(成分是VP-SFM AGT?(Gibco 公司）无血清培养基、0. l%Pluronic F-68、30 μ g/ml硫酸葡聚糖)，生长液应该逐滴滴入， IOml液用时不少于2min,混匀后800rpm,离心3min。弃上清，加入新鲜生长液IOml,轻轻 吹打混匀，将细胞悬液放入100mL三角瓶中，补足生长液30ml摇床培养。培养2d后离心换 液。
[0017] 当细胞生长速率恢复后，将细胞扩大培养在Biofloll5发酵罐，工作体积I. 2L，培 养液组成为：〇. 2%Pluronic F-68、30y g/ml 硫酸葡聚糖、VP-SFM AGT?(Gibco 公司）；培养 条件为：37°C、80~110rpm、D030~50%、ρΗ7· 20 ;细胞接种密度为30~50万/ml。
[0018] 待细胞密度达到3X IO6~4X l〇7ml时，接种流感病毒，接种剂量为MOI=0.00 1~ 〇. 1，另外培养基中添加 1.0~5.0 μ g/ml的TPCK-胰酶(购自Sigma公司）；培养条件为： 33°C、80~110rpm、D030~50%、ρΗ7· 20。80%细胞出现病变、死亡时停止培养，收获病毒液， 测定血凝效价。
[0019] 优选地，所述无血清培养基包括VP-SFM AGT?、MDCK细胞无血清无蛋白化学培养 基、InVitrus?、或SFM4MegaVir?培养基以及所述无血清培养基中的添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚糖。
[0020] 优选地，所述流感病毒为禽流感病毒、猪流感病毒。
[0021] 本发明的又一目的在于提供所述方法制备的流感病毒疫苗。
[0022] 本发明具有以下有益效果：
[0023] 1.解决了细胞传统转瓶培养工艺繁琐复杂，不易实现大规模生产的问题。悬浮 培养细胞可以使细胞获得均衡的营养，可以直观地反映细胞生长代谢的过程，简化了生产 工艺、节省了人力、降低了生产成本，保证了疫苗的稳定性和均一性，且实验操作简单、周期 短。纯悬浮培养既可以选择灌注培养又可以选择流加培养。流加工艺采用不断补充细胞生 长过程中所消耗的营养，来延长细胞生长时间，从而达到细胞高密度，培养病毒的高含量。
[0024] 2.解决了微载体价格昂贵的问题。纯悬浮培养工艺使细胞悬浮在培养罐中，不需 要依附微载体生长，在搅拌力的作用下悬浮在培养基中生长。
[0025] 3.解决了血清添加产生副作用的问题。采用无血清培养基使得在病毒培养或疫苗 生产中遭受外源污染的风险降低，且降低了动物的应激反应，安全系数高，也使得后续病毒 处理如过滤、纯化等步骤更加简单易行，大大减少了工作量。
【附图说明】
[0026] 图1为生物反应器培养过程中悬浮细胞与贴壁细胞生长曲线，图中Viability 代表的是悬浮培养细胞的存活率；Cell density代表的是悬浮培养的细胞密度； adherent-cell代表的是贴壁细胞的密度；
[0027] 图2为本发明MDCK细胞悬浮培养与贴壁培养的流感病毒血凝价比较。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神