具有高纤维素酶活性的菌株及其应用和获得方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有纤维素酶的工程菌株，特别是指一种具有高纤维素酶活性的菌株及其应用和获得方法。
【背景技术】
[0002]纤维素酶是使纤维素降解生产葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β —葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量低寡糖、双糖或单糖。纤维素酶广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化。
[0003]纤维素类物质是自然界中最为丰富的可再生资源之一。利用纤维素酶可以将天然纤维素降解为可利用的糖类，再通过发酵技术转化为生物酒精或其它可利用的生物分子材料，实现生物质材料的高效利用。高效利用木质纤维素对解决资源紧张、粮食短缺和环境污染等问题具有重要意义，采用微生物处理生物质是当前的研宄热点。
[0004]目前制约纤维素材料利用的关键因素之一是纤维素酶降解效率低，纤维素酶用量大，从而造成纤维素转化成本过高。因此，筛选具有高活性纤维素酶的微生物菌株对降低生物质的转化成本，提高生物质材料的转化效率具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提出一株具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌及其应用和获得方法，以提高生物质材料的转化效率，降低纤维素的转化成本。
[0006]基于上述目的，本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌Paenibacillussp.WHl从纸浆污泥中分离得到。
[0007]所述具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WHl已于2014年5月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO:M 2014236。
[0008]经16S rDNA检测分析，菌株WHl与类芽抱杆菌(Paenibacillus sp.)的16S rDNA最为相似，具有99%的序列同源性。因此鉴定筛选得到的具有高纤维素酶活性的菌株WHl为 Paenibacillus。
[0009]本发明还提供一种获得上述具有高纤维素酶活性的菌株的方法，括以下步骤:
[0010]将纸浆污泥溶解在磷酸缓冲液中，取上清液；
[0011]将所述上清液稀释后涂布接种于琼脂平板生长培养基R2A，选择直径中等，形态边缘整齐、中间凹陷，颜色呈灰白色的菌落；
[0012]将获得的菌落在LB培养基中培养，取培养后的菌液滴于羧甲基纤维素钠平板培养基中，以大肠杆菌为阴性对照，纤维素酶生产用纤维单胞菌为阳性对照，筛选获得比阳性对照具有更高纤维素酶活性的菌株，即为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.WH1。
[0013]在本发明的一个实施例中，所述琼脂平板生长培养基R2A含有:0.4-0.6g/L酵母提取物，0.4-0.6g/L蛋白胨，0.4-0.6g/L酪蛋白，0.4-0.6g/L葡萄糖，0.4-0.6g/L可溶性淀粉，0.2-0.4g/L 磷酸氢二钾，0.4-0.6g/L 七水硫酸镁，0.2-0.4g/L 丙酮酸钠，10.0-20.0g/L琼脂糖。
[0014]本发明还提供上述具有高纤维素酶活性的菌株在制备纤维素降解制剂中的应用。
[0015]从上面所述可以看出，本发明提供的具有高纤维素酶活性的类芽孢杆菌菌株WH1，从纸浆污泥中分离得到，具有更高的纤维素酶活性，能够广泛应用于食品工业、酿造业、造纸业、饲料工业、纺织工业和生物质转化，提高生物质材料转化效率，降低纤维素转化成本。
【具体实施方式】
[0016]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
[0017]实施例1:
[0018]1、初步筛选
[0019]从造纸废弃场采集纸浆污泥作为样品，分别取样品I克溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，涡旋摇匀，静止30分钟，让残渣下沉，取上清液稀释100倍，涂布接种于琼脂平板生长培养基R2A(0.5g/L酵母提取物，0.5g/L蛋白胨，0.5g/L酪蛋白，0.5g/L葡萄糖，0.5g/L可溶性淀粉，0.3g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.3g/L丙酮酸钠，15.0g/L琼脂糖)。28°C培养，分别培养24、48、72小时后观察平皿中生长的单菌落菌直径大小、形态和颜色。选择直径中等，形态边缘整齐、中间凹陷，颜色呈灰白色的菌落。将获得的菌落反复进行平板划线分离，以获得纯化的菌株，供进一步筛选用。
[0020]在本发明的另一实施例中，上述琼脂平板生长培养基R2A含有:0.4g/L酵母提取物，0.4g/L蛋白胨，0.55g/L酪蛋白，0.45g/L葡萄糖，0.42g/L可溶性淀粉，0.4g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.35g/L丙酮酸钠，18.0g/L琼脂糖。
[0021 ] 在本发明的另一实施例中，上述琼脂平板生长培养基R2A含有:0.6g/L酵母提取物，0.52g/L蛋白胨，0.4g/L酪蛋白，0.5g/L葡萄糖，0.6g/L可溶性淀粉，0.25g/L磷酸氢二钾，0.6g/L七水硫酸镁，0.28g/L丙酮酸钠，18.0g/L琼脂糖。
[0022]2、进一步筛选
[0023]将获得的单菌落28°C在LB培养基中摇菌培养，取5微升培养后的菌液滴于CMC(羧甲基纤维素钠)平板培养基中，以大肠杆菌(Escherichia, coli)为阴性对照，纤维素酶生产用纤维单胞菌(Cellulomonas xylanilytica)为阳性对照，28°C培养48小时。48小时后以革兰氏碘液(2.0g KI and l.0g I, 300ml ddH20)染色，染色后置于28°C条件下培养5分钟。5分钟后测量对比透明圈直径大小，透明圈大说明产纤维素酶高、分解纤维的能力大。含有CMC的培养基呈褐色浑浊，CMC被纤维素酶分解后培养基呈无色透明状。因此通过对比透明圈直径的大小可以直观对比纤维素酶活性差异。筛选获得比阳性对照具有更高纤维素酶活性的菌株。筛选得到纤维素酶活性最高的菌株，命名为WHl。
[0024]3、16S rDNA 检测分析
[0025]将筛选得到的WHl在LB培养基中28°C培养24小时，取培养液2ml离心弃上清，用基因组提取试剂盒，提取细菌基因组DNA。以该DNA为模板，采用16S rDNA通用引物 P-l(5’ -GACTCCTACGGGAGGCAGCAGT)，P- 2 (5 ’ -AGGGTTGCGCTCGTTGCGGG)进行PCR反应，扩增菌体16S rDNA序列。20 μ I的反应体系含PCR缓冲液2 μ 1，正反引物I μΜ, Mg2+2.5m