一种表达Streptomycessp.FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌的制作方法

本发明涉及一种表达streptomycessp.fa1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌，属于基因工程领域。

背景技术：

木聚糖酶属于糖苷水解酶[ec3.2.1.x]，能应用在多个领域中。木聚糖酶和其他半纤维素酶一起添加在饲料中利于增加饲料营养分解；在制浆和造纸工业领域，木聚糖酶可作为预漂白剂处理纸浆，从而降低纸浆漂白过程中化学试剂使用量，减少对环境的污染；在食品领域可以用于面制品烘焙，能够改善面制品的品质；木聚糖酶还用于制备低聚木糖。麻类植物的纤维素含量丰富，是纺织行业中纤维原材料，但是麻类植物中含有半纤维素、木质素、果胶等杂质不利于纺织，木聚糖酶可以进行脱胶以去除这些胶质，因而在纺织工业中木聚糖酶也有相当的应用，可减少化学品对环境的污染。迄今为止，国内外已报道了400多种木聚糖酶基因，大多数木聚糖酶在野生菌中表达量仅在10-20iu·ml^-1。为了进一步推动木聚糖酶在工业生产中的应用，利用分子生物学方法将木聚糖酶基因进行异源表达以提高木聚糖酶的表达水平，是目前普遍采用的木聚糖酶制备方式。

毕氏酵母表达系统主要包括诱导型表达系统和组成型表达系统。诱导型表达系统中使用乙醇氧化酶为启动子(paox1)来诱导表达外源蛋白，期间需要进行初始碳源和甲醇之间的转换，导致存在发酵周期长、操作不方便、需要掌握好碳源的转换时间、甲醇含量难以监测的缺点；此外甲醇属于易挥发、易燃易爆物质，具有一定的生产危险性，不方便大量储存；甲醇还属于剧毒物质，不适用于食品方面的应用，因而制约了paox1表达载体在食品领域的大规模应用。组成型表达系统是最近几年广泛使用的毕氏酵母表达系统，其中三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pgap)是较为常用的同生长相偶联的组成型表达系统启动子，可以利用甘油或者葡萄糖等碳源生长并高效表达外源基因，具有不需要更换碳源、操作便捷的优点。尤其是该启动子利用无毒害性碳源，使pgap质粒构建的组成型表达系统对于表达食品行业用酶制剂具有更重要意义。

外源基因可以整合进宿主基因组进行表达，也能以游离质粒的形式进行表达。整合型表达具有遗传稳定的优点，而游离型表达具有拷贝数高的优点。目前在毕氏酵母表达系统中，木聚糖酶基因均是构建整合型重组菌株进行外源基因重组表达，尚未见到采用游离型表达质粒来进行表达。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定的、可以大量分泌木聚糖酶的游离表达型毕氏酵母重组菌及其构建方法，工业应用前景广阔。

本发明的第一个目的是提供一种表达木聚糖酶的毕氏酵母重组菌，所述毕氏酵母重组菌是将streptomycessp.fa1来源的木聚糖酶基因，连接到含有自主复制序列的游离表达质粒上，转化至毕氏酵母中得到的毕氏酵母重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述木聚糖酶基因氨基酸序列如seqidno:1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述自主复制序列的核苷酸序列如seqidno:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述游离表达载体为通过将核苷酸序列如seqidno:2的pars复制子连接到pgapzαa质粒上得到pgapzαa-pars游离表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述毕氏酵母为毕氏酵母km71、gs115或smd168。

本发明第二个目的是提供一种所述毕氏酵母重组菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获得氨基酸序列如seqidno:1所示的木聚糖酶基因；

(2)获得序列如seqidno:2所示的自主复制序列pars基因；

(3)将步骤(2)所得pars基因与质粒pgapzαa相连，得到表达载体pgapzαa-pars；

(4)将步骤(1)中的木聚糖酶基因与步骤(3)中的表达载体pgapzαa-pars相连，得到重组载体pgapzαa-pars-xyna；

(5)将重组载体pgapzαa-pars-xyna转化到毕氏酵母中，得到所述毕氏酵母重组菌。

本发明的第三个目的是提供所述的毕氏酵母重组菌生产木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以权利要求1所述毕氏酵母重组菌为生产菌株，活化后，30℃、200rpm条件下培养24h，得一级种子发酵液；

(2)以2.5％接种量接种一级种子发酵液至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，得二级种子发酵液；

(3)以10％的接种量将二级种子发酵液接种至发酵培养基中30℃、200rpm进行发酵；

(4)待do值迅速上升时，进行补料，od600＝100时停止补料，饥饿至第二次出现do值迅速上升时继续补料。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为ypd培养基；所述发酵培养基为bsm培养基；其中bsm培养基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l，上述成分均溶于水中形成所述bsm培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述方法中补料配方为50％甘油、1.25％ptm1；甘油和ptm1溶于水中形成所述补料。

本发明的第四个目的是提供所述毕氏酵母重组菌在饲料、食品、纺织或化工领域的应用。

本发明的有益效果

本发明所述重组毕氏酵母工程菌属于带自我复制的游离型载体重组毕氏酵母工程菌。此工程菌相对通用的整合型的重组毕氏酵母工程菌显著提升了分泌生产木聚糖酶的能力。此外发酵原料来源广泛，生产成本较低。

本发明将streptomycessp.fa1来源木聚糖酶(xyna)基因整合到游离含pgap启动子的质粒中再转入毕氏酵母，使其分泌木聚糖酶。同整合型表达菌株相比，采用游离载体表达木聚糖酶产量提高了50％，同时表达的酶的比活力提高了90％，从而显著降低了工业化生产木聚糖酶的生产成本。

附图说明

图1重组质粒pgapzαa-pars-xyna的构建过程图；

图2pgapzαa-pars-xyna重组质粒的双酶切验证图；

图3pgapzαa-pars-xyna重组菌3.6l发酵sds-page电泳图；

图4pgapzαa-pars-xyna重组菌3.6l发酵酶活对比图。

具体实施方式

将0.5g的木聚糖溶于100ml，50mmol/l，ph5.5的磷酸缓冲液充分混匀，取1ml底物，在55℃预热10min，加入1ml的酶液，反应10min后加入3mldns，煮沸10min迅速冷却，加蒸馏水定容至20ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

在上述条件下，将每分钟水解木聚糖糖生成1μmol的木糖所需酶量定义为木聚糖酶的一个单位的酶活力(u)。

实施例1：表达载体pgapzαa-pars的构建

利用全基因合成技术合成核苷酸序列如seqidno.2所示的自主复制序列pars；将回收得到的pars基因片段，用infusion酶与质粒pgapzαa相连，构建得到表达载体pgapzαa-pars。

实施例2：游离型pgapzαa-pars-xyna重组菌的构建

重组质粒pgapzαa-pars-xyna的构建：

以质粒pmd18-t-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)为模板，设计序列如seqidno.3所示的正向引物：ccggaattcatggccgagaacaccctt，序列如seqidno.4所示的反向引物：atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt。通过聚合酶链式反应获得具有noti和ecori酶切位点的xyna片段。

pcr反应体系(50μl)：

pcr程序：94℃，4min(预变性)；98℃，10s(变性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；设置30个循环；72℃，10min(保温)后设置保藏温度为4℃。将pcr产物进行胶回收、酶切回收目的基因将其与表达载体pgapzαa-pars进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化e.colijm109，涂布含zecoin抗性的lb平板，37℃培养8-10h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定dna序列，阳性克隆子即pgapzαa-pars-xyna。见图1和图2。

重组质粒pgapzαa-pars-xyna的转化：

(1)从乙醇中取出电转杯，置于超净台中吹干，并置于冰中预冷备用；

(2)在冰上进行以下操作：将重组游离质粒pgapzαa-pars-xyna预冷，吸取5μl快速与80μl酵母感受态中混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500v，时间控制4-10ms；

(3)迅速向电击杯中加入1ml1mol·l^-1预冷的山梨醇，轻轻吹打均匀，然后将其转移至冰冷的1.5ml无菌ep管中，30℃、50r·min^-1培养1-2h；

(4)离心菌体，重新悬浮均匀后吸取200μl-300μl涂布上还有zecoin抗性的ypd平板上，于30℃恒温条件下培养，至长出单菌落，即为含有游离质粒的重组单菌落。

(5)使用无菌牙签挑取ypd平板上的菌落，接种到ypd培养基中。

(6)从平板上挑取阳性转化子单酵母菌落转接于装有10mlypd培养基的50ml三角瓶中培养24h后转入装有50mlypd培养基的500ml三角瓶培养表达3～4天，培养物经离心后得到含重木聚糖酶的上清，利用dns法对其进行酶活检测。

实施例3：整合型pgapzαa-xyna重组菌的构建

重组质粒pgapzαa-xyna构建：

以质粒pmd18-t-xyna为模板，设计序列如seqidno.3所示的正向引物：ccggaattcatggccgagaacaccctt，序列如seqidno.4所示的反向引物：atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt。通过聚合酶链式反应获得具有noti和ecori酶切位点的xyna片段。

pcr反应体系(50μl)：

pcr程序：94℃，4min(预变性)；98℃，10s(变性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；设置30个循环；72℃，10min(保温)后设置保藏温度为4℃。将pcr产物进行胶回收、酶切回收目的基因将其与表达载体pgapzαa进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化e.colijm109，涂布含zecoin抗性的lb平板，37℃培养8-10h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定dna序列，阳性克隆子即pgapzαa-xyna。

重组质粒pgapzαa-xyna的转化：

重组质粒经saci内切酶线性化，酶切体系如下：

混匀上述溶液，37℃酶切2h，采用琼脂糖凝胶电泳验证酶切得到产物。

(1)从乙醇中取出电转杯，置于超净台中吹干，并置于冰中预冷备用

(2)在冰上进行以下操作：将线性化后回收的pgapzαa-xyna预冷，吸取5μl快速与80μl酵母感受态中混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500v，时间控制4-10ms；

(3)迅速向电击杯中加入1ml1mol·l-1预冷的山梨醇，轻轻吹打均匀，然后将其转移至冰冷的1.5ml无菌ep管中，30℃、50r·min-1培养1-2h；

(4)离心菌体，重新悬浮均匀后吸取200μl-300μl涂布上还有zecoin抗性的ypd平板上，于30℃恒温条件下培养，至长出单菌落，即为整合到基因组的重组单菌落。

(5)使用无菌牙签挑取ypd平板上的菌落，接种到ypd培养基中。

(6)从平板上挑取阳性转化子单酵母菌落转接于装有10mlypd培养基的50ml三角瓶中培养24h后转入装有50mlypd培养基的500ml三角瓶培养表达3～4天，培养物经离心后得到含重木聚糖酶的上清，利用dns法对其进行酶活检测。

实施例4：pgapzαa-pars-xyna重组菌与pgapzαa-xyna重组菌3.6l发酵罐发酵

重组毕氏酵母工程菌发酵罐发酵生产木聚糖酶的方法在3.6linfors罐进行，过程分为三阶段进行：

第一阶段：接种实施例3或实施例5中的阳性转化子单菌落至装有10mlypd培养基的50ml三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，作为一级种子发酵液；

第二阶段：取所述一级种子发酵液2.5ml接种于装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，作为二级种子发酵液；

第三阶段：将100ml的种子发酵液接种到装有900mlbsm培养基中的3.6l发酵罐中，200rpm，30℃的条件下培养，全程用25％氨水进行ph值的调节，保持在5.0；所述bsm培养基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l上述成分均溶于水中形成所述bsm培养基；

待碳源耗尽，即do值迅速上升时，进行补料，待od600＝100时，停止补料，饥饿至第二次出现do值迅速上升时，继续补料，补料配方为50％甘油；1.25％ptm1；甘油和ptm1溶于水中形成所述补料。不同时间段取样。

实施例5：木聚糖酶酶活测定

分别取实施例6中pgapzαa-pars-xyna重组菌与pgapzαa-xyna重组菌产的酶进行酶活测定，实验结果见图4。结果表明，整合型pgapzαa-xyna重组菌获得的木聚糖酶的最大酶活力235u/ml，蛋白含量2.7mg/ml。游离型pgapzαa-pars-xyna重组菌获得的木聚糖酶的最大酶活力为350u/ml，蛋白含量2.1mg/ml，同整合型pgapzαa-xyna重组菌相比，采用游离载体表达木聚糖酶产量提高了50％，同时表达的酶的比活力提高了90％，从而显著降低了工业化生产木聚糖酶的生产成本。此外，pgapzαa-pars-xyna重组菌所产酶的蛋白电泳结果显示在43kda处有一条与理论分子量一致的条带(结果如图3所示)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种表达streptomycessp.fa1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>436

<212>prt

<213>streptomycessp.fa1

<400>1

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151015

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