一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于壳聚糖酶技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用。

背景技术：

壳聚糖酶(chitosanases，ec.3.2.1.132)广泛存在于古菌、细菌及真核生物中，在糖苷水解酶(glycosidehydrolases，gh)家族3、5、7、8、46、75及80中均有分布，其中，家族46、75及80中仅包含壳聚糖酶。在工业上，由于缺乏经济高效的特异性壳聚糖酶，往往使用蛋白酶及纤维素酶等非特异性商品酶类水解壳聚糖以制备壳寡糖。由于具有壳聚糖酶水解活性的酶类在这些商品酶中所占比例极低，用酶量较大，壳寡糖的生产成本也相应增加。因此，迫切需要研发出一系列经济高效的壳聚糖酶以满足工业壳寡糖生产的需求。

本发明研发人员前期在多种食品级商品酶中筛选具有壳聚糖水解酶活性的酶制剂时发现，使用枯草芽孢杆菌发酵生产的淀粉酶及中性蛋白酶均具有较好的壳聚糖水解活性(1g粗酶干粉约可彻底水解30g壳聚糖)，提示这些商品酶的来源菌株枯草芽孢杆菌中具有壳聚糖酶编码基因。我们通过基因组检索发现，枯草芽孢杆菌中存在壳聚糖酶的编码基因。为获得更安全高效的壳聚糖酶，我们对该基因进行了密码子优化并在毕赤酵母中进行分泌表达。表达的壳聚糖酶能够替代现有的商品酶用于壳寡糖的规模生产。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用；旨在提供一种经济高效的特异性壳聚糖酶。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明通过对枯草芽孢杆菌壳聚糖酶编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中实现分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶。

本发明提供的一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的制备方法为：将核苷酸序列如seqidno.2所示的壳聚糖酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的壳聚糖酶。

所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于枯草芽孢肝菌的壳聚糖酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pgbg1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有壳聚糖酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞gs115中，诱导并获得分泌表达的壳聚糖酶；(4)利用诱导表达的壳聚糖粗酶上清对壳聚糖底物进行水解并使用高效液相色谱方法对产物的聚合度进行分析。本发明所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶可单独用于壳聚糖的降解制备壳寡糖；或者所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶与其他壳聚糖酶或几丁质酶混合使用，协同降解壳聚糖或几丁质。

所述表达载体pgbg1的获得方式是：通过对表达载体ppic9中的信号肽序列(详见seqidno.4所示)进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的新的信号肽序列(详见seqidno.5所示)，并利用nsii/xhoi双酶切将seqidno.5所示的信号肽序列替代原先的seqidno.4所示信号肽，得到表达载体pgbg1。该表达载体pgbg1能够使目的蛋白在毕赤酵母中更高效的分泌表达。

其中，表达载体ppic9和毕赤酵母细胞gs115均为商业化产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明的壳聚糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。枯草芽孢杆菌已被用于包括淀粉酶、蛋白酶及木聚糖酶等多种食品用酶制剂的发酵制备，菌株及其来源的酶类安全性有保障，而巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统也已被用于乳糖酶及磷脂酶c等食品级酶制剂的表达，其自身也用于木聚糖酶的生产(gb2760-2014)。因此，使用枯草芽孢杆菌来源的壳聚糖酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物壳聚糖酶可成为食品级壳寡糖的生产用酶制剂。

2.本发明中的壳聚糖酶基因由于根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行了优化，可实现在毕赤酵母中高效分泌表达。酶活测定结果显示，发酵上清中的粗酶酶活为281800u/g，比现有专利文献(cn102816751a)中通过蜡样芽胞杆菌固体发酵并纯化获得的壳聚糖酶活性提高约10倍，且本发明中的粗酶液无需经过纯化即可直接用于食品级壳寡糖的制备。同时，我们将本发明的粗酶液与商品中性蛋白酶(来源于枯草芽孢杆菌)进行了水解壳聚糖活性对比，结果发现，本发明0.3mg酶可完全水解5g壳聚糖，而商品酶的对应用量则为150mg。因此，与商品酶相比，分泌表达的壳聚糖酶效率提高达500倍，具有替代现有商品酶用于规模制备壳寡糖的巨大应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例中的重组表达载体bscsn-pgbg1及其酶切产物凝胶电泳图谱。

图2为本发明实施例中含壳聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的发酵液上清的sds-page图谱。

图3为本发明实施例中壳寡糖cos-94-bscsn的高效液相色谱图。

图4为本发明实施例中壳寡糖cos-62-bscsnmaldi-tof质谱图。

图5为本发明实施例中壳寡糖cos-94-bsnp的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1壳聚糖酶基因的密码子优化及全基因合成

在不改变氨基酸序列的前提下，对来源于枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶编码基因进行密码子优化，优化后的密码子全部为毕赤酵母偏爱密码子，具体序列见seqidno.2。优化后的核苷酸序列bscsn与原始序列(genbankaccessionnumber:al009126，如seqidno.3所示)相比，有195个核苷酸发生了变化，核酸序列同源性为74％。同时，为了使壳聚糖酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的壳聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的35个氨基酸，具体序列见seqidno.1。优化后的基因序列委托生工进行全合成，合成获得的基因序列命名为壳聚糖酶基因bscsn。

实施例2壳聚糖酶基因bscsn的表达载体构建

首先使用限制性内切酶xhoi及noti对含有壳聚糖酶基因bscsn的克隆载体进行双酶切，获得目的基因片段，同时使用相同的内切酶对表达载体pgbg1进行双酶切，回收大片段。两个回收产物进行连接，获得重组载体，命名为bscsn-pgbg1。为确定目标壳聚糖酶基因已经构建至载体中，我们分别使用xhoi/noti及bglii对该重组载体进行双酶切及单酶切，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：经双酶切后，出现了稍大于750bp的片段，与bscsn的片段762bp相符；经bglii酶切后，出现了预期的两个片段，依次为含有目的基因的大片段和含有抗性基因的小片段。

实施例3壳聚糖酶毕赤酵母工程菌的筛选及壳聚糖酶制备

将获得的重组质粒bscsn-pgbg1经限制性内切酶bglii线性化后，凝胶电泳分离并切取含有目的基因的核苷酸片段(如图2所示的较大的片段)，电击导入毕赤酵母gs115中，将通过组氨酸营养缺陷md平板上筛选得到的重组子平铺在含有胶体壳聚糖(0.5％)的bmmy琼脂平板上进行培养，从中进一步筛选出水解圈最大的单克隆菌株。将筛选的单克隆菌株的单菌落接种于200mlbmgy培养基中，30℃及250rpm下培养48小时，离心弃上清，加入200ml的bmmy培养基进行诱导表达。24h后补加甲醇至其终浓度为1％，以后每隔24h补加一次，共计诱导120h后离心，上清液即为含有壳聚糖酶(记为壳聚糖酶bscsn)的粗酶液。使用sds-page检测蛋白表达情况，其结果如图2所示。bradford法测定粗酶液中的蛋白质浓度为0.3mg/ml；dns法测定其比酶活为84.54u/ml，因此，理论上1g壳聚糖酶bscsn的酶活为281800u。上述的md琼脂平板、bmmy琼脂平板、bmgy培养基、bmmy培养基为酵母表达系统常用的培养基，可直接购买或者按照现有文献技术配制均可。

实施例4壳聚糖酶bscsn水解高脱乙酰度壳聚糖制备壳寡糖

称取50g壳聚糖(脱乙酰度：94％)，加至1000ml1.5％乙酸水溶液中，ph5-6。充分溶解后，加入10ml发酵的壳聚糖酶bscsn粗酶液，40℃下搅拌反应48小时。反应结束后，离心去除不容物，上清经旋转蒸发仪在40℃下浓缩至约300ml，后经冷冻干燥得成品壳寡糖，命名为cos-94-bscsn。称取一定量制备的壳寡糖cos-94-bscsn，配置成浓度为20mg/ml的水溶液，过滤后用于高效液相色谱分析。高效液相色谱仪连接蒸发光散射检测器用于壳寡糖的信号检测，使用xamide色谱柱(华谱新创科技有限公司)对壳寡糖进行分离，乙腈浓度递减(70％-50％)方式洗脱，柱温为30℃，检测器气压23psi，流速：1ml/min。流动相为0.1m甲酸胺(ph3.2)、乙腈及水溶液。洗脱时间：40min。结果如图3所示，从图3可以看出，得到的壳寡糖产物为聚合度2-6的壳寡糖。

实施例5壳聚糖酶bscsn水解低脱乙酰度壳聚糖制备壳寡糖

称取50g壳聚糖(脱乙酰度：62％)，加至1000ml1.5％乙酸水溶液中，(ph5-6)。充分溶解后，加入10ml发酵的壳聚糖酶bscsn粗酶液，40℃下搅拌反应48小时。反应结束后，离心去除不容物，上清经旋转蒸发仪在40℃下浓缩至约300ml，后经冷冻干燥得成品壳寡糖命名为cos-62-bscsn。由于该产物组分较为复杂，难以通过液相对组分进行有效分离，因此采用maldi-tof质谱方法对其组分进行分析。具体方法为：称取一定量制备的cos-62-bscsn，配制成浓度为2mg/ml的水溶液，过滤后吸取1μl点样至样品板上，待其自然干燥后，加入1μl基质2,5-二羟基苯甲酸(dhb)溶液，待其干燥后使用autoflexⅲsmartbeam型maldi-tof质谱仪(bruker公司)进行检测(正离子反射模式)。质谱检测结果如图4所示：为便于区分，以a代表n-乙酰氨基葡萄糖，d代表氨基葡萄糖，随后的数字代表含有该单糖的个数，二者加和为寡糖的聚合度。从图4的结果来看，低脱乙酰度壳寡糖cos-62-bscsn组分较复杂：质谱方法可检测到聚合度2-14的寡糖，且同一个聚合度下存在不同乙酰度的壳寡糖。

对比例6来源于枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶制备壳寡糖

称取50g壳聚糖(脱乙酰度：94％)，加至1000ml1.5％乙酸水溶液中，ph5-6。充分溶解后，加入1.5g商品中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌发酵制备)，40℃下搅拌反应48小时。反应结束后，离心去除不容物，上清经旋转蒸发仪在40℃下浓缩至约300ml，后经冷冻干燥得成品壳寡糖，命名为cos-94-bsnp。称取一定量制备的壳寡糖cos-94-bsnp，配置成浓度为20mg/ml的水溶液，过滤后用于高效液相色谱分析。高效液相色谱仪连接蒸发光散射检测器用于壳寡糖的信号检测，使用xamide色谱柱(华谱新创科技有限公司)对壳寡糖进行分离，乙腈浓度递减(70％-50％)方式洗脱，柱温为30℃，检测器气压23psi，流速：1ml/min。流动相为0.1m甲酸胺(ph3.2)、乙腈及水溶液。洗脱时间：40min。结果如图5所示，得到的壳寡糖产物为聚合度2-6的壳寡糖。与本发明10ml粗酶液(约含蛋白3mg)完全水解50g壳聚糖相比，使用商品中性蛋白酶时，用量为1.5g，约为粗酶液用量的500倍。因此，本发明的壳聚糖酶应用于壳寡糖的工业制备时，可大幅度降低用酶成本。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

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<110>中科荣信（苏州）生物科技有限公司

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