本发明属于粮食储藏技术领域，具体涉及一株广谱拮抗储粮主要危害霉菌的芽孢杆菌菌株、其抗菌代谢物制备方法、芽孢杆菌菌株及其抗菌代谢物在粮食储藏中的应用。
背景技术：
相对于世界上其他国家而言，我国粮食储藏年限较长，平均储藏年限为3年。在长期储藏中，储粮不可避免会受外界环境因素及粮堆水分迁移的影响，从而发生霉菌生长、代谢、产毒。霉菌生长代谢可分解粮食中的营养成分，使粮食品质发生不同程度的劣变。据不完全统计，全世界每年仅粮食霉变造成的损失就达总产量的3％以上，我国每年由于霉菌危害活动造成的粮食损失量高达150亿至200亿公斤，折合金额高达180亿至240亿元。另外，霉菌代谢活动还可产生有毒的或致癌性的真菌毒素，全世界谷物供应量的25％受到真菌毒素的污染，带来了严重的食品安全问题。目前我国批准使用的饲料、粮食防霉剂大部分为化学防霉剂，长期使用化学防霉剂造成储粮主要危害霉菌产生抗性、污染环境、药剂残留、损害仓储工作人员健康等一系列后果，目前粮食储藏减损领域对绿色生物防霉技术需求强烈。而国内外尚没有微生物源的防霉剂商业化应用于粮食储藏领域。
芽孢杆菌是一类在自然界中广泛存在的好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，抗逆性强，易于培养。枯草芽孢杆菌更是国际上公认的安全菌种之一，被美国FDA和环保署列为可商业上应用的微生物菌种，也是我国农业部规定的免做安全鉴定的一级菌种之一。目前，芽孢杆菌及其代谢物主要用于植物病害防治，在粮食防霉方面的研究、应用极少。中国专利(申请号200510038629.6)公布的枯草芽孢杆菌抗菌肽仅具有抑制黄曲霉的作用，抑菌谱窄，实际应用价值低；中国专利(申请号201310263918.0)公布的枯草芽孢杆菌LPL-NM45仅具有在玉米储藏中抑制黑曲霉、串珠镰刀菌、草酸青霉的作用，抑菌谱有限，应用开发潜力有限。
本发明的提供的枯草芽孢杆菌菌株LM3403及其抗菌代谢物在粮食储藏减损方面具有巨大的应用价值和市场开发潜力。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株广谱拮抗储粮主要危害霉菌的芽孢杆菌菌株、其抗菌代谢物制备方法、芽孢杆菌菌株及其抗菌代谢物在粮食储藏中的应用。
本发明提供的菌株LM3403（Bacillus subtilis LM3403）已于2014年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9377，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明提供了所述枯草芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物。
本发明还提供了枯草芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物的制备方法，其特征在于，所述方法为：将活化后的枯草芽孢杆菌LM3403接种于液体培养基中，35℃、200r/min培养48h，得到发酵液；发酵液于4℃下9500rpm离心15min，得到发酵上清液。向发酵上清液中加入无机酸或有机酸，调节至pH2，4℃过夜；4℃下9500rpm离心15min，收集沉淀，用少量1％无菌碳酸氢胺溶液溶解，通过干燥至含水量13％以下，即得到抗菌代谢物。
所述培养基，可以是LB培养基、NA培养基、Landy培养基等，优选为Landy培养基。Landy培养基：谷氨酸5g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；KCl 0.5g/L；酵母膏1g/L；L-苯丙氨酸2mg/L；MnSO4 5mg/L；CuSO4·5H2O 0.16mg/L；FeSO4·7H2O0.15mg/L；葡萄糖20g/L；KH2PO4 1g/L；pH 7.0。
所述无机酸，可以是盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等，优选为浓盐酸。
所述有机酸，可以是酒石酸、苯甲酸、柠檬酸等有机酸，优选为柠檬酸固体。基于食品安全考虑，优选为食品级柠檬酸。
所述干燥，可以是常压干燥、喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥、流化床干燥等，优选为冷冻干燥。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物在粮食储藏中的防霉应用，所述粮食优选为小麦、玉米。
本发明的有益效果：
本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株属于是国际上公认的安全菌种，被美国FDA和环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一，也是我国农业部规定的免做安全鉴定的一级菌种之一。
本发明提供的枯草芽孢杆菌LM3403对禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、黄曲霉、黑曲霉、灰绿曲霉、烟曲霉、草酸青霉、扩展青霉等储粮主要危害霉菌均具有较好的抑制作用，抑菌谱广，适用范围大，应用开发潜力大。
本发明所述枯草芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物易于制备、易于规模化生产、生产成本低。
本发明所述枯草芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物对储粮主要危害霉菌的生长均具有显著的抑制作用。
储藏试验结果显示，添加芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物能够有效抑制粮食储藏过程中霉菌的生长，保障粮食储藏安全。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：芽孢杆菌LM3403分离筛选和鉴定
采用稀释涂布法从采集自海拔3000米以上高寒无污染草原上生长的野牦牛牛粪样品中分离纯化出形态差异明显的各细菌菌落，编号，保存备用。
采用平板对峙法从上述分离纯化得到细菌菌株中筛选对霉菌具有广谱拮抗能力的菌株，得到广谱拮抗能力最强的菌株，命名为LM3403。
实施例2：芽孢杆菌LM3403种属鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株形态学观察和生理生化特性分析。菌株LM3403在NA平板上菌落圆形、不透明乳白色、较黏稠、边缘不整齐；细胞呈杆状，革兰氏阳性，芽孢中生、椭圆形。菌株LM3403在NA平板上菌落圆形、不透明乳白色、较黏稠、边缘不整齐；细胞呈杆状，革兰氏阳性，芽孢中生、椭圆形。需氧生长，可运动，V-P试验阳性，过氧化氢酶试验阳性，吲哚试验阳性，淀粉水解阳性，酪蛋白水解阳性，明胶液化阳性，葡萄糖发酵试验阳性，硝酸盐还原阳性，尿素利用阳性。菌株LM3403的形态特征、生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准株保持一致。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以通用引物27F和1492R为引物，对菌株16S rDNA进行PCR扩增。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程有限公司纯化测序。将测序结果与GenBank数据库中已知的16S rDNA序列进行BLAST比对。菌株PCR产物经纯化后测序得到1439bp的序列(GenBank登录号KJ906613)，经BLAST比对，发现菌株LM3403的16S rDNA序列与Bacillus subtilis strain SPA N1(JQ308575)、Bacillus subtilis strain ME2(JQ900623)和Bacillus subtilis strain BDT3(HQ711982)的同源性达到100％。
综合分析确定菌株LM3403为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例3：菌株LM3403抑菌谱
以禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、黄曲霉、黑曲霉、灰绿曲霉、烟曲霉、草酸青霉、扩展青霉、高大毛霉等储粮主要危害霉菌为指示菌，采用对峙培养法测定菌株LM3403的广谱抑菌能力，结果见表2。
表1菌株LM3403抑菌谱
注：“+”表示抑菌带宽＜3mm，“++”表示抑菌带宽在3-5mm，“+++”表示抑菌带宽＞5mm
实施例4：枯草芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物制备
将活化后的枯草芽孢杆菌LM3403接种于液体培养基中，35℃、200r/min培养48h，得到发酵液；发酵液于4℃下9500rpm离心15min，得到发酵上清液。向发酵上清液中加入食品级柠檬酸固体，调节至pH2，4℃过夜；4℃下9500rpm离心15min，收集沉淀，用少量1％无菌碳酸氢胺溶液溶解，通过冷冻干燥至含水量13％以下，即得到抗菌代谢物。
实施例5：抗菌代谢物对霉菌生长的影响
采用含药平板法考察抗菌代谢物对霉菌生长的影响。将霉菌接种于PDA平板活化5d，用无菌打孔器打孔制得直径6mm的菌饼，将菌饼接种于含有一定浓度抗菌代谢物的PDA平板中心，28℃培养5d，测算霉菌菌落直径，计算生长抑制率，生长抑制率(％)＝(空白对照组菌落直径-实验组菌落直径)/空白对照组菌落直径×100％，每组3次重复，计算平均数。其中，空白对照组平板抗菌代谢物浓度为0μg/mL，实验组平板抗菌代谢物浓度为100μg/mL。
表2抗菌代谢物对霉菌生长的抑制
实施例6：模拟小麦储藏试验
收集高水分小麦样品，以实施例4制备的抗菌代谢物作为防霉剂进行模拟储藏试验，参照GB 4789.15-2010进行霉菌带菌量的检测，通过霉菌带菌量的对比，衡量芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物的防霉效果。
本实施例中的小麦样品水分含量经检测为14.8％，分别随机取1Kg小麦样品装入无菌玻璃器皿，试验组按质量分数添加5‰的抗菌代谢物，充分混匀，空白对照组不添加，每组3次重复，置于相对湿度70％的Binder KMF720恒温恒湿培养箱中进行模拟储藏。霉菌最适生长温度在30℃左右，因此模拟储藏温度设置为30℃。
表3储藏期间小麦霉菌带菌量变化(×103CFU/g)
由表3可知，随着储藏时间的延长，空白对照组小麦霉菌带菌量逐渐增加，储藏35d时霉菌带菌量已经达到初始带菌量的200倍以上，并可闻到明显的霉味，储藏60d时出现明显霉变；抗菌代谢物试验组霉菌带菌量在储藏前期(14d前)出现小幅度的增加，但增加并不显著；储藏中期开始，试验组霉菌带菌量水平较初期虽有所增大，但显著低于空白对照组，且储藏60d时霉菌带菌量仍与初始带菌量保持在同样的103CFU/g水平，霉菌生长受到了很好的控制。说明芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物在小麦储藏中具有良好的防霉效果。
实施例7：模拟玉米储藏试验
收集高水分玉米样品，以实施例4制备的抗菌代谢物作为防霉剂进行模拟储藏试验，参照GB 4789.15-2010进行霉菌带菌量的检测。通过霉菌带菌量的对比，衡量芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物的防霉效果。
本实施例中的玉米样品水分含量经检测为15.5％，分别随机取1Kg玉米样品装入无菌玻璃器皿，试验组按质量分数添加5‰的抗菌代谢物，充分混匀，空白对照组不添加，每组3次重复，置于30℃、相对湿度70％的Binder KMF720恒温恒湿培养箱中进行模拟储藏。
表4储藏期间玉米霉菌带菌量变化(×103CFU/g)
同样，由表4可知，随着储藏时间的延长，空白对照组玉米霉菌带菌量逐渐增加，储藏35d时霉菌带菌量已达到初始带菌量的200倍左右，并可闻到明显的霉味，储藏45d时即出现明显霉变；而抗菌代谢物试验组在整个储藏期霉菌带菌量与初始带菌量保持在同样的103CFU/g水平，有效抑制了储藏玉米中霉菌的生长。说明芽孢杆菌LM3403抗菌代谢物在玉米储藏中具有良好的防霉效果。
虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式对本发明作了详尽的描述，但对于本领域的技术人员来说，依然可以对上述所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换或者优化；而这些修改或替换或优化，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
1atgctataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga
61 cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg
121 ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc
181 acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga
241 cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac
301 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg
361 ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc
421 cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc
481 cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc
541 tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg
601 gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg
661 cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg
721 aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg
781 atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac
841 tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca
901 agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat
961 cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg
1021 gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg
1081 atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg
1141 aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca
1201 atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc
1261 agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat
1321 cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga
1381 gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aagtgacag