一种新的短小芽孢杆菌漆酶基因及其表达与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种漆酶基因，尤其是一种短小芽孢杆菌L-9的漆酶基因及其表达与 应用，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 漆酶〇^(：(^%3.(：.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还 原反应，在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广泛， 包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨大。 在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健康的 伤害及对环境的污染;在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸厂的 污染，有助于造纸业最终实现清洁生产;在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类化合 物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，减 少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。
[0003]漆酶按来源不同可分为三大类:植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。植物漆酶主要由 漆树漆液分离而得。真菌漆酶来源更为广泛(存在于多种担子菌中），具单电子氧化还原电 位高、催化活性强等优点，既能催化底物的氧化聚合又能对木质素进行催化降解，是一直以 来人们重点研究的漆酶种类。细菌漆酶则发现相对较晚，最初是1993年由Givaudan等人首 先在一种生脂固氮螺菌中鉴定出来的。随后，科研人员又陆续在交替单胞菌、大肠杆菌、假 单胞菌、粘质沙雷氏菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、极端耐碱芽孢杆菌、灰色链霉菌等细 菌中发现了不同种类的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽孢杆菌的CotA蛋白、 海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌的CueO蛋白、灰色链霉菌的EpoA蛋白等，这些细菌漆酶与真 菌漆酶蛋白结构相似，都具有4个铜离子结合位点。
[0004]由于真菌来源漆酶在工作环境pH偏碱性时活性非常低或几乎没有，热稳定性也较 差，且丝状真菌生长周期长，培养基要求高，菌丝在发酵罐中易受到高剪切力的损伤，这大 大限制了真菌漆酶在工业上的应用。研究揭示，细菌来源漆酶虽氧化活性普遍略低于真菌 来源漆酶，然而它们往往具有一些自身独特的优点：如无需糖基化修饰、热稳定性好、酶活 性的最适pH范围广等，这些性质正是目前漆酶工业应用所急需的。
[0005]据最新资料统计，我国每年印染废水排放量占总工业废水排放量的35%，己成为 危害最大的重要污染源，大部分合成染料都难以被微生物降解。这些染料化合物通常被用 于纺织、食品、塑胶和生物医学的着色剂，每年全世界商用染料使用达7X105吨，种类达IX 1 〇4种，其中5~10 %的染料都以工业污水形式排放出来。有色污水直接释放到环境中，许多 染料在厌氧环境下可能转化为有毒物质或致癌物质，众多国家相继都颁布了严厉的法规来 限制工业染料污水的排放。由于染料自身特殊的化学结构，使用物理或化学法(凝结、臭氧、 活性炭)处理往往效果不佳，且还易造成二次污染。研究表明，生物法(使用漆酶、锰过氧化 物酶等)具有脱色率高、运行成本低、绿色环保的优势，是处理印染废水的潜在有效手段，是 当前印染废水脱色研究的热点。绝大多数排放的工业印染污水往往温度很高且pH值偏碱。 在各类来源的漆酶中，真菌漆酶由于只在pH偏酸环境下具有较好的脱色效果，在偏碱性条 件下难以发挥作用，且耐热温度低于细菌漆酶，所以细菌漆酶凭借其独特优势在工业印染 废水处理中更具应用潜力。
[0006]因此，挖掘能耐受高温和高pH值(耐碱)条件的细菌漆酶基因并实现规模化生产具 有重要研究意义和应用价值。
[0007] 本研究组在先专利申请201310261242.1中，公开了一种漆酶基因，来源于短小芽 孢杆菌，以SGZ为底物时，最适作用pH为7.2;以2，6-DMP为底物时，最适作用pH为7.8，最适作 用pH值均高于(耐碱性能力)其他已报道过的微生物来源漆酶;该漆酶以SGZ为底物时，最适 作用温度为80°C，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。如何进一步提高生物酶的高温稳定性需 要进一步做出研究。
【发明内容】
[0008]本发明的第一个目的在于提供一种新的漆酶基因cotA，其核苷酸序列为在核苷酸 序列为SEQIDNO. 1所示核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成的高温稳 定的漆酶。
[0009] 所述突变位点为第57位Lys突变为Thr、第120位Lys突变为Thr。
[0010] 所述基因编码的蛋白质及含有所述基因的转基因细胞系、基因工程菌、表达载体 或克隆载体均属于本发明保护的范围。
[0011] 本发明的第三个目的在于提供上述重组漆酶在印染废水脱色中的应用，尤其是对 偶氮类和蒽醌类染料脱色的应用。
[0012] 本发明分析了纯化的重组漆酶对2种代表性偶氮类和2种代表性蒽醌类染料的脱 色作用，偶氮类染料和蒽醌类染料是目前印染工业上使用量最大的两种染料类型。实验结 果显不在碱性环境pH9.0,90°C温度作用10h后，该漆酶对2种偶氮类染料reactivered11 和reactiveblue171的脱色率分别达到98%以上，对2种蒽醌类染料reactiveblue4和 reactivebri11iantblue的脱色率分别达到96%以上。控制温度在90°C，2小时后，酶的剩 余活力为85%，10小时后，酶的剩余活力为75%，具有优异的高温稳定性。
[0013]本名提供的漆酶具有良好的脱色效果，同时具有优秀的高温稳定性，具有很广的 应用前景。
【具体实施方式】
[0014]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0015]下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0016]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0017]实施例1CotA基因的获得
[0018] 通过化学全合成或定向突变基因克隆方法获得在核苷酸序列为SEQIDNO. 1所示 核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成的高温稳定的漆酶。
[0019] 所述突变位点为第57位Lys突变为Thr、第120位Lys突变为Thr。
[0020]实施例2漆酶的大肠杆菌重组表达、纯化、活性染色及免疫印迹鉴定[0021] 将获得的CotA基因序列克隆到商业化表达质粒pColdII(TaKaRa公司），构建重组 质粒pColdll-cotA。随后将pColdll-cotA转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，通过氨苄抗生 素平板筛选阳性转化子，随后利用IPTG进行漆酶的诱导表达。
[0022]培养基成分为:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯 化钠(NaCl)lOg/L，pH7.4。诱导表达条件为:将重组表达质粒pColdll-cotA转化大肠杆菌 BL21(DE3)，含重组质粒的工程菌在37°C条件下培养至0D6Q() = 0.5,随后转入15°C培养并加 入终浓度为O.lmM的IPTG，诱导表达24h，转速160rpm。诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni+ 柱亲和层析法纯化得到可溶性漆酶，咪唑洗脱浓度为500mM。
[0023]实施例3纯化的B.pumilus L-9重组漆酶高温稳定性分析
[0024]采用常规测定方法，使用SGZ作为底物，反应pH为6.9。1个酶活单位定义为1分钟内 氧化1以1底物362所需的酶量。控制温度在90°(3,2小时后，酶的剩余活力为85%，10小时后， 酶的剩余活力为75%，体现出了优异的高温稳定性。
[0025]实施例4漆酶在碱性条件下对偶氮类和蒽醌类染料的脱色率测定。
[0026]本发明分析了纯化的重组漆酶对2种代表性偶氮类和2种代表性蒽醌类染料的脱 色作用，偶氮类染料和蒽醌类染料是目前印染工业上使用量最大的两种染料类型。实验结 果显不在碱性环境pH9.0,90°C温度作用10h后，该漆酶对2种偶氮类染料reactivered11 和reactiveblue171的脱色率分别达到98%以上，对2种蒽醌类染料reactiveblue4和 reactivebrilliantblue的脱色率分别达到98%以上。以上数据表明该漆酶良好的脱色 效果与碱性稳定性。
[0027]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种新的短小芽孢杆菌漆酶基因cotA，其特征在于其核苷酸序列为在核苷酸序列为 SEQIDNO. 1所示核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成的高温稳定的漆 酶。2. 权利要求1所述的短小芽孢杆菌漆酶基因cotA，其特征在于所述突变位点为第57位 Lys突变为Thr、第120位Lys突变为Thr。3. 权利要求1所述基因编码的蛋白质。4. 含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。5. 含有权利要求1所述基因的基因工程菌。6. 含有权利要求1所述基因的表达载体或克隆载体。7. 根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，优选重组大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)〇8. -种权利要求7所述生产漆酶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，选取大肠杆 菌冷休克表达载体pColdll，构建重组表达载体pColdll-cotA，以大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)为宿主进行表达。9. 一种权利要求7所述生产漆酶的重组大肠杆菌生产漆酶的方法，其特征在于，利用 IPTG对重组菌产漆酶进行诱导表达;所述诱导表达条件为IPTG诱导终浓度为O.lmM，诱导温 度15°C，诱导时间24h，转速160rpm;培养基成分为:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化 钠10g/L，pH7.4。10. 权利要求1所述基因在印染废水脱色中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)漆酶基因突变体及其重组表达与应用，属于生物工程领域。本发明公开的漆酶突变体具有良好的耐碱性和耐高温能力佳的优点，耐高温可高达90℃对偶氮类染料和蒽醌类染料均具有很好的脱色效果，具有重大应用潜力。
【IPC分类】C02F101/16, C12N9/02, C12N15/53, C12N15/63, C12N1/21, C02F3/00
【公开号】CN105420253
【申请号】CN201510918392
【发明人】管政兵, 廖祥儒, 张宁, 宋晨萌
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月11日