抗菌肽cc31在枯草芽孢杆菌中的表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，在机体受到病毒、细菌等攻 击时被诱导产生。抗菌肽具有广谱抗菌作用，尤其是对一些产生抗生素耐药性的病原菌的 杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肽在农业、医疗、食品等领域的应用潜力巨大。迄 今为止，已经发现了上千种天然抗菌肽，但是具有较好的医疗选择指数的种类却比较少，因 此，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肽的设计等方式从丰富的天然抗菌肽资源 中获得理想的新型人工抗菌肽。
[0003] 杂合抗菌肽的设计特点是集两个（或以上）天然肽的优点于一身，经过适当的 人工修饰后，可以扬长避短，最大程度上发挥抗菌活性，并不引起溶血。天蚕素抗菌肽 (cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家绳天蚕素抗菌肽（CecMd)是 本实验室经诱导家蝇幼虫，然后克隆得到的（同源性81% )。而Chensirin是近年来发现 的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有较高的溶血活性。通过对两 者进行杂合设计，获得了低溶血，高抗菌活性的新型杂合抗菌肽CC31，与天然肽相比具有很 大的优势。本研究团队已将抗菌肽CC31在大肠杆菌、毕赤酵母表达体系成功表达，尚未开 展在其他菌种表达体系方面的研究，为此，我们将抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌表达体系进 行表达研究。
[0004] 枯草芽孢杆菌（B.Subtilis)作为外源基因的表达宿主，具有如下优点：（1) B.Subtilis是好氧菌不含热源脂多糖（lipopolysaccharides，LPSs)，有益菌无致病性； B.Subtilis被美国FDA认可为安全性菌株。（2)B.Subtilis细胞膜为单层，而大肠杆菌的为 双层，分泌的蛋白在B.Subtilis体系下比在大肠杆菌体系下更容易回收、纯化，操作简便， 许多酶都是B.Subtilis产生的分泌到胞外的蛋白。（3)长期的研究表明，B.Subtilis没有 明显的密码子偏爱性。（4)B.Subtilis对培养基的要求比较简单，在生产中绝对占有经济 优势，噬菌体、质粒都可作为克隆载体，B.Subtilis有良好的转录翻译系统，可以避免形成 错误折叠的蛋白质、包涵体。（5)B.Subtilis的单基因、芽孢的形成等都受多基因调控；16S rRNA3'端的序列也有别于大肠杆菌。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种分离纯化简单、蛋白纯度高、适于大规模工业 化生产的抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0007] 抗菌肽CC31在枯草芽孢杆菌中的表达方法，包括如下步骤：
[0008] S1、抗菌肽基因的合成及克隆载体的构建
[0009]S11、设计如下两对四条引物，每对都具有互补序列；
[0010] FI：5r -GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA-3,
[0011] R1 ： 5r -ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC-3r
[0012] F2 ： 5r -ACGTGTTGGCCAACATACCCGTATTATTCCGCTGCCGCTGGGTTATTTTGCGAA-3r
[0013] R2-.5' -TCCCCCGGGTTAGGTTTTTTTCGCAAAATAACCCAGCGGCAGCG-3'
[0014] S12、将引物FI与Rl、F2与R2在如下的PCR反应体系中分别进行延伸，得到延伸 液P1、P2。具体步骤如下（以P1的PCR反应体系为例）：提前开起PCR仪预热，将2XTaq MasterMix25μL、上游引物F1 (10μΜ) 2μL、下游引物R1 (10μΜ) 2μL、RNase-Freewater 21yL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中。反应条件为：94°C预变 性2min;30个循环（94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s) ;72°C终延伸2min，得延伸 液P1。同理，可获得延伸液P2;
[0015]S13、以第一次PCR得到的相应延伸液P1与P2相互作为彼此的模板和引物进 行PCR，具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2XTaqMasterMix25yL、P10. 5yL、 Ρ20· 5μL、RNase-Freewater24μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR 仪中。反应条件为：94°C预变性2min;30个循环（94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸 30s) ;72°C终延伸2min，得抗菌肽基因；
[0016]S14、将所得的抗菌肽基因与克隆载体pMD18-T载体连接，在0.2mL微量离心管中， 加入PMD18-TVectorlyL，胶回收后的抗菌肽基因2yL，ddH202yL，Solution1(冰上 融化）5yL，全量为10yL;混合均匀，瞬时离心后；置于连接仪中，4°C，12h，得pMD18-T/ CC31 ；
[0017] S15、将含有表达载体pHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10yg/mLCm的LB培养 基中，37°C，200rpm振荡过夜培养，提取质粒，将其与-20 °C保存的鉴别正确的克隆质粒分 别进行双酶切，酶切体系如下：XbaIlyL、SamIlyL、质粒DNA10yL、CutSmartBuffer 2yL、灭菌的双蒸水6yL;酶切反应条件为：37°C水浴，3h，其中质粒DNA分别为：pHT43、 PMD-18T/CC31 质粒；
[0018]S16、取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离心，使溶液聚集在试管底部，37°C 水浴3h后，酶切反应完全；
[0019]S17、将酶切好的CC31基因片段和酶切后的质粒pHT43进行连接，即可构建成质粒 载体PHT43/CC31，连接反应体系如下：CC31 基因 6yL、10XT4DNAligaseBufferlyL、质 粒ρΗΤ432· 5μL、T4DNAligase0· 5μL;连接反应条件为：16°C水浴，过夜；
[0020]S2、重组表达载体pHT43/CC31转化到宿主细胞中，构建三种表达工程菌菌株；
[0021] S3、将步骤S2所得的表达工程菌以IPTG为诱导剂表达，获得表达产物；
[0022] S4、分离纯化所得的表达产物，获得抗菌肽蛋白CC31，并检测其正确性。
[0023] 其中，所述步骤S2中的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB800N。
[0024] 其中，所述步骤S3中的表达产物为离心上清液。
[0025] 其中，所述步骤S4中所述分离纯化采用高效液相色谱法（HPLC)纯化，利用质谱法 (MS)检测其正确性。
[0026] 上述所得的抗菌肽CC31在制备治疗革兰氏阴和/或革兰氏阳性菌疾病药物、动物 饲料添加剂中的应用。
[0027]本发明选择pHT43作为表达载体，pHT43载体中插入了一个多克隆位点（BamHI， XbaI，AatII，SmaI)和高效SD序列，所选择的酶切位点是XbaI和SmaI。而宿主菌 又有多种，但是天然的B.Subtilis在胞外分泌过程中会分泌一些胞外蛋白酶，可能会改变 目的蛋白的基本性能，所以出现了很多敲除可以分泌胞外酶基因的B.Subtilis，如WB600、 WB700、WB800N等，本发明选择敲除了 8个基因的WB800N为宿主菌。
[0028] 本发明具有以下有益效果：
[0029] 应用基因工程技术在枯草芽孢杆菌中高效表达了抗菌肽CC31，经实验证实种抗菌 肽对多种细菌有杀菌作用，表达产物稳定性较好，分离纯化简单，易操作，易放大，适于大规 模工业化生产，对研制新型高效的CC31抗菌饲料添加剂、抗菌药物等具有重要价值。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明实施例中第一次PCR产物电泳图。其中，1为DNA标准分子量；5 :P2 片段73bp;6为P1片段62bp。
[0031] 图2为本发明实施例中第二次PCR产物电泳图。其中，1为DNA标准分子量；2为 杂合抗菌肽CC31 113bp。
[0032] 图3为本发明实施例中重组克隆质粒为模板PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，1 为杂合抗菌肽CC31 113bp;4为DNA标准分子量；5为阴性对照。
[0033] 图4为本发明实施例中重组克隆质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1、5 为DNA标准分子量；3为杂合抗菌肽CC31 113bp;4 :阴性对照。
[0034] 图5为本发明实施例中重组表达载体的PCR鉴定。其中，3为重组载体CC31PCR产 物283bp。引物分别为：
[0035] F31 :5' -TTGTCAGTTTGCCGATTACA-3'
[0036] R31 :5' -CTATTCCTAATAAGCCGATA-3'
[0037] 图6为本发明实施例中重组质粒的酶切鉴定。其中，1为DNA标准分子量；3为重 组载体CC31酶切产物113bp。
[0038] 图7为本发明实施例中3条抗菌肽的Tricine-SDS-PAGE分析。其中，1为空质粒 上清液；3为CC31样品上清液3. 6kDa;5为标准蛋白Marker。
【具体实施方式】
[0039] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0040] 实施例1 [0041 ] 构建表达载体
[0042] a抗菌肽基因的合成及克隆载体的构建
[0043] 采用SOEingPCR技术来完成杂合抗菌肽CC31在体外的基因合成。抗菌肽设计如 下两对四条引物，每对都具有互补序列，经过两步PCR合成抗菌肽基因，并与pMD18-T克隆 载体相连，形成克隆重组质粒pMD18-T/CC31。
[0044] CC31 氨基酸序列：GWLKKIGKKIERVGQHTRIIPLPLGYFAKKT
[0045] CC31 ：113bp
[0046] GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGAACGTGTTGGCCAACATACCCGTATTATTC CGCTGCCGCTGGGTTATTTTGCGAAAAAAACCCCCGGGGGA
[0047] FI ：5r ~GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA~3/
[0048] R1 ： 5r -ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTT0TTGCCGATTTTTTTC-3r
[0049] F2 ： 5r -ACGTGTTGGCCAACATACCCGTATTATTCCGCTGCCGCTGGGTTATTTTGCGAA-3r
[0050] R2 -.5' -TCCCCCGGGTTAGGTTTTTTTCGCAAAATAACCCAGCGGCAGCG~3〇
[0051] 采用SOEingPGR方法合成抗菌肽基因结果如图1、2,方法如下：
[0052] 第一次PCR时，F1与刚、F2与R2分别进行延伸，得到延伸液P1、P2、。反应体系如 下（以F1与R1为例）：
[0053]
[0054] 提前开起PCR仪预热，将上述试剂加入到PCR反应管中，混合均匀后瞬时离心，放 入PCR仪中。反应条件为：94°C预变性2min:30个循环（94°C变性30s，63°C退火30s，72°C 延伸30s) :72。C终延伸2min。待反应结束，从中取5yL进行电泳检测（含有EB的1. 5% 琼脂糖凝胶），剩余的部分暂-4°C存放。
[0055] 第二次PCR时，以第一次PCR得到的相应延伸液（P1与P2)相互作为彼此的模板 和引物进行PCR，反应体系如下：
[0056]
[0057] 提前开起PCR