一种枯草芽孢杆菌泡腾制剂的制备方法
【专利摘要】本发明属于畜禽、水产动物、毛皮动物、宠物养殖领域，涉及一种用于家畜、家禽、水产动物、毛皮动物、宠物用枯草芽孢杆菌泡腾制剂的制备方法。所制备的枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片具有耐9种抗菌药物，耐pH值2.0酸，耐0.03%胆盐，耐85℃高温，溶化或崩解速度快，稳定等特点。本发明生产的泡腾粉、泡腾颗粒、泡腾片，均包括以下重量份数的原料：枯草芽孢杆菌菌粉（1.0×1011cfu/g）2～20份、酸源1～20份、碱源0.9～26份、微晶纤维素0.5～5份、水溶润滑剂0.5～5份、填充剂24～95.1份。使用上述泡腾制剂饲喂养殖动物，肉鸡日增重提高5%以上，料肉比降低2%以上，每只肉鸡经济效益增加0.8元以上；蛋鸡产蛋率提高2%以上，料蛋比降低2%以上；仔猪日增重提高5%以上，料肉比降低4%以上。
【专利说明】
一种枯草芽孢杆菌泡腾制剂的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于畜禽、水产动物、毛皮动物、宠物养殖领域，涉及一种用于家畜、家禽、水产动物、毛皮动物、宠物用枯草芽孢杆菌泡腾制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]抗生素和合成抗菌药(以下简称抗菌药物)作为饲料添加剂，因残留和畜禽产品安全问题，其使用已受到了严格的限制，饲用微生态制剂如枯草芽孢杆菌等的一个重要性质是对病原菌有不同程度的抑菌活力，且无毒副、残留作用，可以避免抗菌药物应用的一些弊端，因而饲用微生态制剂可以部分代替抗菌药物。
[0003]从抗菌药物和饲用微生态制剂的作用机理及应用技术上看，饲用微生态制剂在很长一段时间内很难完全取代抗菌药物，当抗菌药物的使用范围限制到一定程度时，必将有一个抗菌药物与饲用微生态制剂配合使用的时期，因此了解饲用微生态制剂对各类常用抗菌药物的敏感性、筛选耐药菌株至关重要。
[0004]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是农业部公告第2045号允许使用的饲料添加剂，是一种可形成芽孢的好氧型革兰氏阳性菌，具有生产条件要求相对简单、耐温度变化、快速复活、快速生长、较强分泌酶等特点。广泛应用于家畜、家禽、水产动物、毛皮动物、宠物养殖中。
[0005]目前大多数枯草芽孢杆菌菌株对常见的抗菌药物敏感，与抗菌药物联用时必须间隔一定的时间，筛选耐药菌株十分必要。
[0006]从发酵技术来讲，枯草芽孢杆菌有固态发酵和液态发酵2种常用技术，其中固态发酵技术操作简便但不够精细、易受杂菌污染、菌体含量不易控制、产品质量不稳定;而液态发酵是采用现代发酵技术，对整个发酵过程都可以进行精细的过程控制，具有便于无菌操作，容易控制菌体含量，产品质量稳定的特点，但技术水平要求较高，相对固态发酵投资要高，但更适合工业化生产。本发明优化了枯草芽孢杆菌耐药菌株的液态发酵工艺。
[0007]目前饲用枯草芽孢杆菌制剂以普通粉剂或液体为主，市场竞争激烈。泡腾型枯草芽孢杆菌制剂具有极高的商业价值。
【发明内容】
[0008]本发明涉及一种用于家畜、家禽、水产动物、毛皮动物、宠物用枯草芽孢杆菌泡腾制剂的制备方法。所制备的枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片具有耐9种抗菌药物，耐pH值2.0酸，耐0.03%胆盐，耐85°C高温，溶化或崩解速度快，稳定等特点。具体包括以下步骤:
51、菌株筛选:筛选出耐9种抗菌药物的枯草芽孢杆菌菌株待用；
52、对SI所得枯草芽孢杆菌菌株活化、发酵、离心，得菌粉待用；
53、筛选酸源、碱源、酸碱比例、填充剂，与菌粉等混合制成泡腾制剂。
[0009]菌株筛选的具体步骤为:采用肉汤稀释法分析枯草芽孢杆菌对阿莫西林、硫酸粘菌素、硫酸新霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、盐酸林可霉素、酒石酸泰乐菌素、氟苯尼考、盐酸多西环素、乳酸环丙沙星9种抗菌药物的敏感性。结果枯草芽孢杆菌对硫酸粘菌素、磺胺间甲氧嘧啶钠耐药，对阿莫西林、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸林可霉素敏感性较低，对酒石酸泰乐菌素、盐酸多西环素、乳酸环丙沙星敏感性较高。根据9种抗菌药物对枯草芽孢杆菌的MIC，选择稀释倍数最小的抗菌药物磺胺间甲氧嘧啶钠，取第I孔内液体加入营养肉汤培养基培养枯草芽孢杆菌悬液。于灭菌的营养肉汤培养基中分别加入不同稀释倍数的阿莫西林、酒石酸泰乐菌素、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、盐酸林可霉素、乳酸环丙沙星并作倍比稀释，然后每管加入培养的枯草芽孢杆菌悬液，置37°C培养24h，再将含有药物的培养物连转3次;把一定浓度的该抗菌药物加入到营养肉汤琼脂培养基中，用接种环从第3次的培养物中挑取菌液进行划线，置37°C培养24h。然后提高抗菌药物浓度重复上面步骤逐步筛选出耐9种抗菌药物枯草芽孢杆菌高耐菌株。所筛选的枯草芽孢杆菌菌株最高可耐受阿莫西林72yg/mL、硫酸粘菌素85.7yg/mL、硫酸新霉素115.5yg/mL、磺胺间甲氧啼啶钠259μ区/1111^、盐酸林可霉素18(^8/1111^、酒石酸泰乐菌素153.7548/1111^、氟苯尼考5(^8/1111^、盐酸多西环素175.Syg/mL、乳酸环丙沙星53.2yg/mL，耐pH值2.0酸、耐0.03%胆盐，耐85 °C高温。
[0010]对上述筛选的枯草芽孢杆菌菌株进行发酵工艺优化，以营养肉汤为发酵培养基，通过测定枯草芽孢杆菌的生长曲线，认为枯草芽孢杆菌在24h发酵液菌体浓度最高，发酵时间确定为24h。对不同碳源(葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精、甘露醇、麸皮)、不同氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、花生饼粉、豆饼粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素)、不同无机盐(NaCl、FeS04、ZnS04、CuS04、MnS04.H2O^MgSO4.7H20)对枯草芽孢杆菌发酵的影响进行了单因素试验，确定了以玉米粉作为碳源，花生饼粉作为氮源，MnSO4.H20、FeS04作为无机盐。选择玉米粉浓度、花生饼粉浓度、MnSO4.H2O浓度、初始pH值、接种量设计五个因素四水平的LI 6(45)正交试验，最终确定枯草芽孢杆菌菌株的最佳培养条件为:玉米粉1%、花生饼粉2%、MnSO4.H2O0.07%、初始pH值7.0，接种量为2%。之后研究了装液量对发酵的影响，通过优化确定枯草芽孢杆菌菌株最佳发酵条件为:玉米粉1%、花生饼粉2%、MnS04.H2O0.07%、Fe SO40.0 2% ^ NaH2PO4.2H20 0.2% ^ Na2HPO4.2H20 0.4%，初始 pH 值 7.0，装液量 20%，接种量2%，发酵温度37 °C，发酵24h。
[0011 ]将发酵液离心得1.0 X 10ncfu/g枯草芽孢杆菌菌粉。
[0012]选择柠檬酸、酒石酸、硼酸、苹果酸、富马酸、乙二酸、乳酸8种酸，选择碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙5种碱对枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片进行验证，通过检测PH值、活菌数、发泡量、崩解时限或溶化性。筛选出柠檬酸、酒石酸、硼酸、苹果酸、富马酸中的一种或几种作为最佳酸源，碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或几种作为最佳碱源。单因素方差分析5个酸碱比例对枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片的pH值、发泡量、崩解时限或溶化性的差异性，确定1: 0.9?1: 1.3为最佳酸碱比例。选择乳糖、蔗糖、葡萄糖、水溶淀粉做填充剂，通过检测发泡量、崩解时限或溶化性、颗粒和片表面光滑程度，确定乳糖、蔗糖或水溶淀粉为填充剂。生产枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片各3批，结果活菌数、pH值稳定，发泡量高，崩解时限或溶化性在3min以内。经过18个月的稳定性考察，枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片水分略有增加，PH值、发泡量、活菌数略有降低，崩解时限或溶化性略有延长，但均在标准要求范围内；其他指标不变，产品质量稳定。保质期定为18个月。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0014]菌株筛选的具体步骤为:采用肉汤稀释法分析枯草芽孢杆菌对阿莫西林、硫酸粘菌素、硫酸新霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、盐酸林可霉素、酒石酸泰乐菌素、氟苯尼考、盐酸多西环素、乳酸环丙沙星9种抗菌药物的敏感性。结果9种抗菌药物对枯草芽孢杆菌的MIC分别为:阿莫西林9yg/mL、硫酸粘菌素>85.7yg/mL、硫酸新霉素7.219yg/mL、磺胺间甲氧啼啶钠>259yg/mL、盐酸林可霉素22.5yg/mL、酒石酸泰乐菌素2.402yg/mL、氟苯尼考3.125yg/mL、盐酸多西环素0.343^^/!!^、乳酸环丙沙星0.SOSlIgAiLt3根据9种抗菌药物对枯草芽孢杆菌的MIC，选择稀释倍数最小的抗菌药物磺胺间甲氧嘧啶钠，取第I孔内液体加入营养肉汤培养基培养枯草芽孢杆菌悬液。于灭菌的营养肉汤培养基中分别加入国家标准最高推荐用量稀释8倍的阿莫西林、稀释256倍的酒石酸泰乐菌素、稀释16倍的硫酸新霉素、稀释64倍的氟苯尼考、稀释1024倍的盐酸多西环素、稀释8倍的盐酸林可霉素、稀释512倍的乳酸环丙沙星并作倍比稀释，然后每管加入培养的枯草芽孢杆菌悬液，置37°C培养24h，再将含有药物的培养物连转3次;把一定浓度的该抗菌药物加入到营养肉汤琼脂培养基中，用接种环从第3次的培养物中挑取菌液进行划线，置37°C培养24h。然后提高抗菌药物浓度重复上面步骤逐步筛选出耐9种抗菌药物枯草芽孢杆菌高耐菌株。所筛选的枯草芽孢杆菌菌株最高可耐受阿莫西林72yg/mL、硫酸粘菌素85.7yg/mL、硫酸新霉素115.5yg/mL、磺胺间甲氧啼啶钠259yg/11^、盐酸林可霉素180卩8/1111^、酒石酸泰乐菌素153.75卩8/1111^、氟苯尼考50卩8/1]11^、盐酸多西环素175.Syg/mL、乳酸环丙沙星53.2yg/mL，耐pH值2.0酸、耐0.03%胆盐，耐85 °C高温。
[0015]选择玉米粉1%、花生饼粉2%、MnS04.H2O0.07%^FeS040.02%^ΝβΗ2Ρ04.2Η20 0.2%、Na2HPO4.2Η20 0.4%，初始pH值7.0，装液量20%，接种量2%，发酵温度37 °C，发酵24h生产3批枯草芽孢杆菌发酵液，将发酵液5000r/min离心1min得到菌粉，3批菌粉活菌数分别为1.26X10ncfu/mL、I.18 X10ncfu/mL、I.22X10ncfu/mL。
[0016]实施例1:选择柠檬酸做酸源，选择碳酸氢钠做碱源，酸碱比例1:1.1，选择乳糖做填充剂。将枯草芽孢杆菌菌粉10份与微晶纤维素I份、乳糖29份、柠檬酸10份混合，过24目筛备用或制成酸颗粒;将枯草芽孢杆菌菌粉10份与微晶纤维素I份、乳糖28份、碳酸氢钠11份混合，过24目筛备用或制成碱颗粒，将酸粉末与碱粉末按1:1比例混合得泡腾粉，将酸颗粒与碱颗粒按1:1比例混匀得泡腾颗粒或加水溶润滑剂聚乙二醇6000 0.5份，按常规方法压片得泡腾片。按上述工艺生产枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片各3批，结果活菌数、pH值稳定，发泡量高，崩解时限或溶化性在3min以内。
[0017]实施例2:选择柠檬酸、酒石酸做酸源，选择碳酸钠做碱源，酸碱比例1:1.3，选择蔗糖和乳糖I: I做填充剂。将枯草芽孢杆菌菌粉I份与微晶纤维素0.5份、乳糖20.25份、蔗糖20.25份、柠檬酸5份、酒石酸3份混合，过24目筛备用或制成酸颗粒;将枯草芽孢杆菌菌粉I份与微晶纤维素0.5份、乳糖19.05份、蔗糖19.05份、碳酸钠10.4份混合，过24目筛备用或制成碱颗粒，将酸粉末与碱粉末按1:1比例混合得泡腾粉，将酸颗粒与碱颗粒按1:1比例混匀得泡腾颗粒或加水溶润滑剂聚乙二醇4000 I份，按常规方法压片得泡腾片。按上述工艺生产枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片各3批，结果活菌数、pH值稳定，发泡量高，崩解时限或溶化性在3min以内。
[0018]实施例3:选择硼酸、酒石酸做酸源，选择碳酸氢钠、碳酸钾做碱源，酸碱比例I:
0.9，选择蔗糖和水溶淀粉4:1做填充剂。将枯草芽孢杆菌菌粉5份与微晶纤维素2.5份、蔗糖26份、水溶淀粉6.5份、硼酸5份、酒石酸5份混合，过24目筛备用或制成酸颗粒;将枯草芽孢杆菌菌粉5份与微晶纤维素2.5份、水溶淀粉6.7份、蔗糖26.8份、碳酸钾4份、碳酸氢钠5份混合，过24目筛备用或制成碱颗粒，将酸粉末与碱粉末按1:1比例混合得泡腾粉，将酸颗粒与碱颗粒按1:1比例混匀得泡腾颗粒或加水溶润滑剂聚乙二醇4000 0.5份1￥?-1(30 1.5粉，按常规方法压片得泡腾片。按上述工艺生产枯草芽孢杆菌泡腾粉、颗粒、片各3批，结果活菌数、PH值稳定，发泡量高，崩解时限或溶化性在3min以内。
[0019]使用上述泡腾制剂饲喂养殖动物，肉鸡日增重提高5%以上，料肉比降低2%以上，每只肉鸡经济效益增加0.8元以上；蛋鸡产蛋率提高2%以上，料蛋比降低2%以上;仔猪日增重提高5%以上，料肉比降低4%以上。
【主权项】
1.一种枯草芽孢杆菌泡腾制剂的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤: 51、菌株筛选:筛选出耐9种抗菌药物的枯草芽孢杆菌菌株待用； 52、对SI所得枯草芽孢杆菌菌株活化、发酵、离心，得菌粉待用； 53、筛选酸源、碱源、酸碱比例、填充剂，与菌粉等混合制成泡腾制剂。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌泡腾制剂，其特征在于，所筛选的枯草芽孢杆菌菌株最高可耐受阿莫西林72yg/mL、硫酸粘菌素85.7yg/mL、硫酸新霉素115.5yg/mL、磺胺间甲氧啼啶钠259yg/mL、盐酸林可霉素180yg/mL、酒石酸泰乐菌素153.75yg/mL、氟苯尼考50μg/mL、盐酸多西环素175.5yg/mL、乳酸环丙沙星53.2yg/mL，耐pH值2.0酸、耐0.03%胆盐，耐85°C高温。3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌泡腾制剂，其特征在于，以玉米粉1%、花生饼粉2%、MnS04.H200.07%、FeS040.02%、NaH2P04.2H20 0.2%^Na2HPO4.2H20 0.4%为培养基，初始pH值7.0，装液量20%，接种量2%，发酵温度37 °C，发酵24h的枯草芽孢杆菌发酵液，离心得1.0X 10nCfu/g枯草芽孢杆菌菌粉。4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌泡腾制剂，其特征在于，泡腾制剂包括:泡腾粉、泡腾颗粒、泡腾片，均包括以下重量份数的原料:枯草芽孢杆菌菌粉(1.0 X 10ncfU/g)2?20份、酸源I?20份、碱源0.9?26份、微晶纤维素0.5?5份、水溶润滑剂0.5?5份、填充剂24?95.1份。5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌泡腾制剂，其特征在于，酸源为柠檬酸、酒石酸、硼酸、苹果酸、富马酸中的一种或几种，碱源为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或几种，水溶润滑剂为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、PVP-K30中的一种或几种，填充剂为蔗糖、乳糖、葡萄糖、水溶淀粉中的一种或几种。6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌泡腾制剂，其特征在于，将枯草芽孢杆菌菌粉与适量的微晶纤维素、填充剂、酸源混合，过24目筛备用或制成酸颗粒;将枯草芽孢杆菌菌粉与适量的微晶纤维素、填充剂、碱源混合，过24目筛备用或制成碱颗粒，酸碱比例为1:0.9?I: 1.3，将酸粉末与碱粉末混合得泡腾粉，将酸颗粒与碱颗粒按比例混匀得泡腾颗粒或加水溶润滑剂，按常规方法压片得泡腾片。
【文档编号】A23K10/18GK105941834SQ201610418643
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】张晓云, 刘学彬, 周同茂, 王钊, 高国权, 冯英珍, 冯欣璞, 许灿, 李玉佳, 段宝轩
【申请人】麦氏（石家庄）饲料科技有限公司