一种酶连接产物转化枯草芽孢杆菌构建工程菌株的方法
【专利摘要】本发明涉及一种酶连接产物转化枯草芽孢杆菌构建工程菌株的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)扩增编码透明质酸合成的基因；(2)构建基因与载体质粒的酶连接体系；(3)酶连接体系纯化回收，得到酶连接产物；(4)将酶连接产物转化枯草芽孢杆菌宿主感受态细胞；(5)工程菌株验证。本发明省去了在大肠杆菌构建表达质粒的环节，成功实现了直接将酶连接产物转化入枯草芽孢杆菌，简化传统工程菌株构建流程，减少实验步骤缩短菌株构建周期，提高基因克隆成功率。
【专利说明】
一种酶连接产物转化枯草芽孢杆菌构建工程菌株的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种酶连接产物转化枯草芽孢杆菌构建 工程菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸(hyaluronic acid，HA)是广泛存在于人和动物体内的一种酸性粘多糖， 是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺交替构成的直链多糖，在1934年由美国哥伦比亚大学眼 科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离。透明质酸广泛分布于生物体各部位，并以其独特 的分子结构和理化性质在生物体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁 的通透性，促进创伤愈合等。透明质酸在多种产品中已经开发应用，包括药物载体和活性透 明质酸。
[0003] 透明质酸的合成有两种方法，一是从鸡冠或牛眼玻璃体中进行提取，二是通过生 物合成利用微生物进行发酵提取获得。传统的生物组织提取方法受限于原料来源的限制， 并且动物组织中有可能携带过敏原不利于这种方法的推广开发。微生物发酵行业的发展为 生物合成透明质酸带来机遇，人们首先从链球菌的荚膜中发现了透明质酸的合成代谢，并 进行了工业化应用的推广。
[0004]目前在微生物发酵生产透明质酸领域里多选用枯草芽孢杆菌作为宿主，常规的构 建透明质酸工程菌株的流程为，透明质酸合成相关基因的扩增、回收扩增产物与载体进行 酶切、连接酶连接、转化大肠杆菌感受态细胞、质粒提取及验证，将经过验证的质粒转化枯 草芽孢杆菌感受态细胞并进行转化子验证，最终获得工程菌株。
[0005] 大肠杆菌作为一种常用的基因克隆宿主，是一种典型的兼性厌氧型细菌，由于体 积小，表面积与体积的比例很大，并且能利用氧气进行彻底生物氧化释放大量的能量，因而 能够与外界迅速进行物质和能量交换，并在体内迅速转化。人们对其细胞形态及生理生化 特性已经了解比较深入，对于培养基配制与运载体导入的具体技术等方面也更容易把握， 在构建产透明质酸的枯草芽孢杆菌过程中，通常会在大肠杆菌中构建基因 hasA、tuaD、 gtaB、pgi、gcaD等的表达质粒，再将测序验证的表达质粒转化枯草芽孢杆菌的感受态细胞， 但发明人在研究中发现，透明质酸合成相关基因在大肠杆菌中克隆成功率并不高，需通过 多次尝试才能获得目的基因的表达质粒，有研究表明可能是由于异源基因的表达引起了大 肠杆菌宿主的致死效应或无法预期的基因突变。Bill W等在文章 Hyaluronic acid production in Bacillus subtilis·中[Applied&Environmental Microbiology,2005,71 (7) :3747-3752]提到hasA基因的表达严重限制了大肠杆菌细胞的生长能力，降低克隆成功 率。因此，需要对这种常规的基因克隆表达方式进行再优化。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶连接产物直接转化枯草芽孢 杆菌从而构建产透明质酸工程菌株的方法。该方法将酶连接产物直接转化枯草芽孢杆菌宿 主，减少基因克隆常规流程中大肠杆菌转化和质粒验证这一环节，缩短实验周期，提高基因 克隆的成功率。
[0007] 本发明提供了一种酶连接产物转化枯草芽孢杆菌构建产透明质酸工程菌株的方 法，包括如下步骤：
[0008] (1)扩增编码透明质酸合成的基因；
[0009] (2)构建基因与载体质粒的酶连接体系；
[0010] (3)酶连接体系纯化回收，得到酶连接产物；
[0011] (4)将酶连接产物转化枯草芽孢杆菌宿主感受态细胞；
[0012] (5)工程菌株验证。
[0013] 根据本发明一些实施例，步骤（1)所述的编码透明质酸合成的基因包括编码透明 质酸合成酶的hasA基因、编码UDP-葡萄糖脱氢酶的tuaD基因、编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷 转移酶的gtaB基因、编码氨基转移酶的glmS基因、编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因、编 码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的gcaD基因。
[0014] 根据本发明一些实施例，hasA基因可以来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌（Streptococcus equi)或类马链球菌（Streptococcus equissp); tuaD基因、gtaB基因、pgi基因、gcaD基因、glmS基因可来源于链球菌属 (Streptococcus species)、大肠杆菌（Escherichia coli )或枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)〇
[0015] 根据本发明一些实施例，步骤(2)所述构建基因与载体质粒的酶连接体系，将编码 透明质酸合成酶的hasA基因重组至表达载体质粒pAXOl，将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的tuaD 基因与编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶的gtaB基因及启动子P43基因片段串联重组至表 达载体质粒pDG 17 30，将编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pg i基因与编码UDP-N-乙酰氨基葡萄 糖焦磷酸化酶的gcaD基因重组至表达载体质粒pHTOl。
[0016] 根据本发明一些实施例，步骤(2)所述构建基因与载体质粒的酶连接体系，使用的 限制性内切酶选自BamHI、BglII、SmaI、SpeI、EcoRI、SalI、MfeI、PstI，使用的连接酶为 T4DNA Ligase。
[0017] 根据本发明的一些实施例，步骤(3)所述酶连接反应体系纯化回收为采用乙醇沉 淀后离心方式回收，具体的包括以下步骤:首先，酶连接体系中加入1/10酶连接反应体积的 乙酸钠充分混匀；其次，加入2倍酶连接反应体积的乙醇混合后于_20°C静置30分钟；然后， 12000g离心10分钟，弃去上清液，加入乙醇，12000g离心5分钟，弃去上清液;最后，于室温下 将残留的液体挥发完全，加入水溶解DNA沉淀。
[0018] 根据本发明的一些实施例，步骤(4)所述的将酶连接产物转化枯草芽孢杆菌宿主 感受态细胞，酶连接产物的量应多lyg。
[0019] 根据本发明的一些实施例，步骤(4)所述枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌168 (Bacillus subtilis 168)。
[0020]根据本发明的一些实施例，步骤(4)所述的转化为按照Spizizen转化方法制备枯 草芽孢杆菌的感受态细胞。Spizizen转化方法制备感受态的流程为:菌株接种到GMI培养基 过夜培养，然后取500yL培养液转接至一支新的GMI培养基中振荡培养3.5~6h，最后取750μ L培养液转接至GMII培养基振荡培养1~2h即得感受态细胞。感受态细胞制备完成后与酶连 接产物混合静置lh然后振荡培养lh，涂布于相应的抗性平板过夜培养。
[0021] 根据本发明的一些实施例，步骤(5)所述的工程菌株验证为挑取转化子单菌落进 行PCR验证或培养后提取质粒酶切验证，以筛选确认目标菌株。
[0022] 本发明的优点和有益效果:本发明省去了在大肠杆菌构建表达质粒的环节，成功 实现了直接将酶连接产物转化入枯草芽孢杆菌，简化传统工程菌株构建流程，减少实验步 骤缩短菌株构建周期，提高基因克隆成功率，该方法首次应用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌株构建。经多次实践验证后发现该方法稳定有效，获得了稳定的改造菌 株，实现了透明质酸的生物合成。
【具体实施方式】
[0023]下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不受下述实施例的限定。
[0024]序列表中为相关核苷酸序列信息：
[0025] (l)SEQ ID N0.1为类马链球菌来源的透明质酸合成酶hasA基因编码序列；
[0026] (2)SEQ ID从).2为枯草芽孢杆菌来源的1]〇?-葡萄糖脱氢酶丨皿0基因编码序列；
[0027] (3)SEQ ID勵.3为枯草芽孢杆菌来源的17^-葡萄糖-1_磷酸尿苷转移酶8丨&8基因 编码序列；
[0028] (4)SEQ ID N0.4为枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi基因编码序列； [0029] (5)SEQ ID如.5为枯草芽孢杆菌来源的1]〇?4-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶8(^0 基因编码序列。
[0030] (6)SEQ ID N0.6为启动子P43基因编码序列
[0031] 实施例1基因 hasA表达菌株构建
[0032] (1)基因 hasA的获得
[0033]合成hasA基因 （SEQ ID NO. 1)克隆到载体pUC57中进行保存。以该质粒为模板，弓丨 物hasA-F和hasA-R为一对引物，配制PCR扩增反应体系。其中，引物序列如下：
[0034] hasA-F(SEQ ID NO.7)：TACGCGGATCCATGAGAACATTAAAAAACCTC
[0035] hasA-R(SEQ ID NO.8)：ACGCGGATCCTTATAATAATTTTTTACGTG
[0036] 扩增反应（50yL)含有如下成分：100ng质粒DNA，引物各0.2yM，dATP、dTTP、dGTP、 dCTP各200μΜ，含有ImM MgCl2的5XPrimeSTAR Buffer和2.5单位的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA，Japan)，扩增反应在T-Gradient PCR仪中进行（Biometra，Germany) 〇 扩增程序设置为98°C预变性5min，98°C变性10s，60°C退火5s，72°C延伸1.5min，30个循环， 72°C保温lOmin，4°C温浴。PCR扩增完成后利用Gel Extraction Kit试剂盒（OMEGA， America)切胶纯化回收hasA基因（约1250bp)。
[0037] (2)基因片段和载体酶切处理，并配制酶连接反应体系。利用内切酶BamHI和Sp e I 消化处理hasA基因和载体质粒pAXOl，米用Gel Extraction Kit试剂盒(0MEGA，America)按 厂商说明纯化回收消化产物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明 将纯化回收的基因片段和载体连接，平行进行5个连接反应，16°C恒温处理。
[0038] (3)酶连接体系纯化处理。将5个酶连接反应收集到一支离心管中，然后向体系中 加入1/10体积的乙酸钠充分混匀，然后加入2倍体积的乙醇混合后置于-20°c中30分钟； 12000g离心10分钟，弃去上清液;重新加入lml的70%乙醇，12000g离心5分钟，小心移出上 清液;最后，将EP管的盖子打开使乙醇挥发完全，添加20yL去离子水溶解DNA。超微量核酸蛋 白测定仪(Thermal，America)检测结果显示，回收产物的浓度为150ng/yL，A26()/A28() = l .95。 [0039] (4)纯化产物转化感受态菌株。按照Spizizen转化方法接种培养枯草芽孢杆菌168 菌株并制备感受态细胞，然后将20yL酶连接纯化产物与200yL感受态细胞混合转化，最后富 集为50yL菌液涂布于lyg/mL的红霉素抗性平板中倒置过夜培养。
[0040] (5)转化子验证。利用EmeraldAmp Mix(TAKARA，Japan)配制扩增反应体系，直接利 用转化子作为模板进行菌落PCR扩增反应，验证使用的引物为lacA-F和lacA-R。如果目的基 因整合到宿主基因组中，PCR扩增会产生5500bp的条带。PCR扩增电泳结果显示，有预期扩增 产物出现，说明质粒PAX01携带基因 hasA双交换整合到基因组上，工程菌株构建成功，测序 正确的菌株标记为HAS1。其中，引物序列如下：
[0043] 实施例2基因 tuaD和gtaB表达菌株构建
[0044] (l)PCR扩增基因 tuaD(SEQ ID N0.2)、gtaB(SEQ ID N0.3)。以枯草芽孢杆菌 168菌 株的基因组为模板，利用引物tuaD-F和tuaD-R为一对引物配制PCR扩增体系扩增基因 tuaD， 利用引物gtaB-F和gtaB-R为一对引物配制PCR扩增体系扩增基因 gtaB，利用引物P-F和P-R 为一对引物配制PCR扩增内源启动子P43(SEQIDN0.6)。其中，引物序列如下：
[00511扩增反应(50μυ含有如下成分：100ng枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA，引物组合 中每条引物各0.2以]?，(^了？、(11^?、(16了？、(1(^^各20(^]\1，含有1111]\11^(：12的5\?411165丁八1? Buffer和2.5单位的PrimeSTAR HS DNAPolymerase(TAKARA，Japan)。米用Bacterial DNA Kit试剂盒(0MEGA，America)按厂商说明获得枯草芽孢杆菌168菌株基因组，在T-Gradient PCR仪中进行扩增反应(81〇1^杜3,66^1^即）。扩增程序设置为98°(：预变性51^11，98°(：变性 108,60°(：退火58,72°(：延伸21^11，30个循环，72°(：保温101^11，4°(：温浴。？0財广增完成后利用 Gel Extraction Kit试剂盒(0MEGA，America)切胶纯化回收tuaD基因（约 1400bp)、gtaB基 因（约900bp)及启动子P43的扩增条带（约350bp)。
[0052] (2)基因片段和载体质粒酶切处理，并配制酶连接反应体系。利用限制性内切酶 BamHI和EcoIU酶切消化载体pDG1730质粒，BamHI和SaH酶切消化启动子P43片段，Sail和 Bgin酶切消化基因 tuaD片段，BamHI和Mfel酶切消化基因 gtaB片段，采用Gel Extraction Kit试剂盒(OMEGA，America)按厂商说明纯化回收酶切消化产物。利用DNALi gat ion Kit Ver. 2.1 (TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的三个片段连接至载体pDG 1730，平行进行 5管连接反应，16°C恒温处理。
[0053] (3)酶连接体系纯化处理。收集所有的酶连接体系，向反应体系中加入1/10体积的 乙酸钠溶液充分混匀，然后加入2倍体积的乙醇混合后置于_20°C中30分钟；12000g离心10 分钟，弃去上清液;重新加入lml的70%乙醇，12000g离心5分钟，小心移出上清液;最后，将 EP管的盖子打开使乙醇挥发完全，添加20yL去离子水溶解DNA。超微量核酸蛋白测定仪 (Thermal，America)检测结果显示，回收产物的浓度为100ngAiL，A26〇/A28Q = l .94。
[0054] (4)纯化产物转化感受态菌株。按照Spizizen转化方法接种培养菌株HAS1并制备 感受态细胞，然后将20yL体积的酶连接纯化产物与菌株HAS1的200yL感受态细胞混合转化， 最后富集为50yL菌液涂布于lOOyg/mL的壮观霉素抗性平板中倒置过夜培养。
[0055] (5)转化子验证。平板上的转化子接种到LB淀粉培养基中37°C静置培养24h，然后 添加路哥氏碘液显色，没有出现水解圈的对应菌株即为双交换转化菌株。将该菌株接种培 养并提取基因组，利用引物P-F和gtaB-R为一对组合进行扩增，电泳检测扩增产物的大小为 2700bp，测序检测显示碱基序列完全符合预期，说明启动子P 43、基因 tuaD、基因 gtaB通过质 粒pDGl 730成功整合至基因组表达，菌株标记为HAS2。
[0056] 实施例3基因 pgi和gcaD表达菌株构建
[0057] (l)PCR扩增基因 pgi(SEQ ID N0.4)和基因 gcaD(SEQ ID N0.5)。以枯草芽孢杆菌 168菌株的基因组为模板，利用引物pgi-F和pgi-R为一对引物配制扩增体系扩增基因 pgi， 引物gcaD-F和gcaD-R为一对引物配制扩增体系扩增基因 gcaD，配制PCR扩增体系分别扩增 基因 pgi和基因 gcaD。其中，引物序列如下：
[0062]扩增反应（50yL)含有如下成分：100ng枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA，引物各 0 · 2μΜ，dATP、dTTP、dGTP、dCTP各200μΜ，含有ImM MgCl2的5 X Pr imeSTAR Buf f er和2 · 5单位 的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA，Japan)。米用Bacterial DNA Kit试剂盒 (0MEGA，America)按厂商说明获得枯草芽孢杆菌168菌株基因组，在T-Gradient PCR仪中进 行扩增反应(13;[011161:抑，661'1]^115〇。扩增程序设置为98°(^预变性5111；[11，98°(^变性108,60°0退 火5s，72°C延伸1.5min，30个循环，72°C保温10min，4°C温浴。PCR扩增完成后利用Gel Extraction Kit试剂盒（OMEGA，America)切胶纯化回收pgi基因条带（约1350bp)和gcaD基 因条带（约1350bp)。
[0063] (2)基因片段和载体质粒酶切处理，并配制酶连接反应体系。利用限制性内切酶 BamHI和Ps 11酶切消化pg i基因片段，Ps 11和Sma I酶切消化gcaD基因片段，BamHI和Sma I酶切 消化载体质粒pHTOl，采用Gel Extraction Kit试剂盒(0MEGA，America)按厂商说明纯化回 收酶切消化产物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收 的两个片段连接到载体PHT01中，平行进行5管连接反应，16°C恒温处理。
[0064] (3)酶连接体系纯化处理。收集所有的酶连接体系，向反应体系中加入1/10体积的 乙酸钠溶液充分混匀，然后加入2倍体积的乙醇混合后置于_20°C中30分钟；12000g离心10 分钟，弃去上清液;重新加入lml的70%乙醇，12000g离心5分钟，小心移出上清液;最后，将 EP管的盖子打开使乙醇挥发完全，添加20yL去离子水溶解DNA。超微量核酸蛋白测定仪 (Thermal，America)检测结果显示，回收产物的浓度为110ngAiL，A26〇/A28Q = l .92。
[0065] (4)纯化产物转化感受态菌株。按照Spizizen转化方法接种培养菌株HAS2并制备 感受态细胞，然后将20yL体积的酶连接纯化产物与菌株HAS2的200yL感受态细胞混合转化， 最后富集为50yL菌液涂布于5yg/mL的氯霉素抗性平板中倒置过夜培养。
[0066] (5)转化子验证。平板上的转化子接种到LB培养基过夜振荡培养，并利用Plasmid Mini Kit试剂盒(OMEGA，America)按要求进行提取质粒。提取的质粒利用内切酶BglII酶切 验证，酶切后理论上应该产生3081bp和6213bp的两个条带，电泳检测酶切结果符合预期，质 粒克隆成功。测序检测显示碱基序列完全正确，对应的菌株标记为HAS3。
[0067]实施例4菌株摇瓶发酵检测透明质酸
[0068] 对菌株BS168、HAS1、HAS2和HAS3分别接种摇瓶培养。首先，将上述4个菌株接种到 LB培养基37°C、220rpm过夜培养12h左右，然后1%接种量接种到种子培养基继续培养7h作 为摇瓶种子，再以1%接种量转接至装液量为50mL的摇瓶发酵培养。摇瓶培养基成分为葡萄 糖60g/L、蛋白胨 10g/L、Na2HP〇4· 12H20 6.2g/L、K2S〇4lg/L、MgS〇4〇.97g/L、NaCl lg/L、 FeS04· 7H20 0.005g/L〇
[0069] 对于菌株HAS1、HAS2和HAS3,摇瓶接种培养的同时添加 lOg/L的木糖诱导基因 hasA 的表达，另外菌株HAS3培养过程中需额外添加5yg/mL的氯霉素作为筛选压力、添加 ImM的 IPTG诱导基因 pgi和gcaD的表达。摇瓶振荡培养90h后进行取样测定HA产量。为测定HA的产 量，4°C条件下4000rpm转速离心处理30min收集发酵液上清，然后将发酵液上清转移置另一 离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。4°C条件下静置lh， 再以4000rpm转速离心30min，去除上清液体，白色沉淀加入发酵液等体积1M的NaCl溶液充 分溶解，用于产量的测定。
[0070] 运用改良的味唑法(Bitter and Muir，1962，Anal Biochem.4:330-334)对发酵液 中透明质酸的含量进行检测。以BS168菌株的发酵液作为空白参照，仅表达基因 hasA的菌株 HAS1透明质酸产量为0.7g/L，同时表达hasA、tuaD、gtaB基因的菌株HAS2透明质酸产量为 1.8g/L，在菌株HAS3中进一步过表达基因 pgi和gcaD发酵液中透明质酸产量达到2.1g/L。检 测结果说明，基因 hasA的表达是透明质酸能够积累的必要条件，进一步表达基因 tuaD、gtaB 显著提高了透明质酸的积累水平，引入基因 pgi和gcaD提高透明质酸的得率。
【主权项】
1. 一种酶连接产物转化枯草芽孢杆菌构建工程菌株的方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 扩增编码透明质酸合成的基因； (2) 构建基因与载体质粒的酶连接体系； (3) 酶连接体系纯化回收，得到酶连接产物； (4) 将酶连接产物转化枯草芽孢杆菌宿主感受态细胞； (5) 工程菌株验证。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述的编码透明质酸合成的基因 包括编码透明质酸合成酶的hasA基因，hasA基因来源于兽疫链球菌、马链球菌或类马链球 菌。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述的编码透明质酸合成的相关 基因还包括编码UDP-葡萄糖脱氢酶的tuaD基因、编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶的 gtaB基因、编码氨基转移酶的glmS基因、编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因和编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的gcaD基因中的一种或多种;tuaD基因、gtaB基因、pgi基因、 gcaD基因、glmS基因来源于链球菌属、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述构建基因与载体质粒的酶连 接体系，将编码透明质酸合成酶的hasA基因重组至表达载体质粒pAXOl。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述构建基因与载体质粒的酶连 接体系，将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的tuaD基因与编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶的 gtaB基因及启动子P43基因片段串联重组至表达载体质粒pDG1730,将编码葡萄糖-6-磷酸异 构酶的pgi基因与编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的gcaD基因重组至表达载体质粒 pHTOl。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的酶连接反应体系纯化回收 为采用乙醇沉淀后离心方式回收。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的将酶连接产物转化枯草芽 孢杆菌宿主感受态细胞，酶连接产物的量应多lyg。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽 孢杆菌168。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的转化为按照Sp i z i z en转化 方法制备枯草芽孢杆菌的感受态细胞。
【文档编号】C12N15/53GK105969789SQ201610298462
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】刘维喜, 汪璞, 鲍素敏, 刘权, 李利佳, 张鸿
【申请人】广东东阳光药业有限公司