一种4-羟基异亮氨酸的合成方法
【专利摘要】本发明涉及一种4?羟基异亮氨酸的合成方法，该方法首先构建重组表达质粒，同时表达L?异亮氨酸?4?羟基化酶和L?谷氨酸氧化酶，然后在构建的催化反应体系中加入L?谷氨酸和L?异亮氨酸两种底物作为催化反应的前体合成4?羟基异亮氨酸，经过4h的催化反应，L?谷氨酸和L?异亮氨酸的转化率分别为97.01％和98.45％。本发明使用L?谷氨酸替代α?酮戊二酸作为合成4?羟基异亮氨酸的前体，能高效生产4?羟基异亮氨酸且生产成本低，便于工业化生产。
【专利说明】
一种4-羟基异亮氨酸的合成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种4-羟基异亮氨酸的合成方法。
【背景技术】
[0002] 在生物技术领域中，尽管以大肠杆菌为宿主的相关克隆，表达技术已经非常成熟， 但是异源蛋白的重组表达仍是一个重要的研究内容，为了提高重组蛋白的可溶性和表达 量，需要大量时间和大量的实验室工作，经多次实验、再实验的努力才能达到最后的成功。
[0003] 4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxy isoleucine，4_HIL)是一种主要存在于胡芦巴属植物 种子中的L-异亮氨酸羟化物。4-HIL分子式C6H13N03,分子量147.17，熔点大于200°(：，沸点 332°C，密度1.181g/cm3。研究表明4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌 的活性以及促进肌细胞对血糖吸收、加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作 为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物，4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市 场需求。
[0004] 4-羟基异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、酶催化法和生物法，目前工业 化生产4-羟基异亮氨酸的技术已经较成熟，但主要是重萌芦巴中提取，其产品分离纯化困 难，难以制备，产品纯度低，污染环境严重，大量制备成本高，且该法获得的4-羟基异亮氨酸 构型较多，但仅(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸具有上述生物学活性，从而使得该方法存在提 取率低(仅为0.091-0.6%)。
[0005] 随着生物技术的发展，在研究化学合成4-HIL的过程中尝试引入酶催化反应来简 化一些步骤。酶法合成4-羟基异亮氨酸作为一种新的合成4-羟基异亮氨酸方法，但是需要 加入昂贵的α-酮戊二酸作为底物。Wang等于2002年发明了八步法合成4-HIL，该方法以2-甲 基乙酰乙酸乙酯为原料，在地霉菌的作用下得到（2S，3S)-3-羟基-2-甲基丁酸乙酯，再经过 7步化学合成将其转变成4-HIL。这其中借助地霉菌转化2-甲基乙酰乙酸乙酯是最关键一 步。该方法总收率为39%，且反应条件苛刻、步骤多、而且容易引起环境污染，因此仍停留在 实验室阶段。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种4-羟基异亮氨酸的合成方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0008] -种4-羟基异亮氨酸的合成方法，使用L-谷氨酸作为催化前体酶法合成4-羟基异 亮氨酸，具体步骤如下：
[0009] (1)构建包含L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶基因重组表达载体；
[0010] (2)将步骤(1)中的重组表达载体转化所需菌株，获得基因工程重组菌株；
[0011] (3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨 酸氧化酶的菌体；
[0012] (4)破碎步骤(3)中的菌体，获得粗酶；
[0013] (5)将步骤(4)中获得的粗酶添加入含有L-谷氨酸和L-异亮氨酸的催化液中，利用 酶法合成4-羟基异亮氨酸。
[0014] 优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，步骤(1)中以序列表〈400>1和〈400>2所 示序列为已知ido和lgox原始核苷酸序列，序列表〈400>3和〈400>4所示序列为idol和lgox 针对E.coli BL21(DE3)密码子优化的核苷酸序列，构建得到包含L-异亮氨酸-4-羟基化酶 (ido)和L-谷氨酸氧化酶（lgox)基因的重组表达载体--质粒pETduet-ido-lgox，所得质 粒pETduet-ido-lgox的序列为序列表〈400>5所示序列。
[0015] 优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，步骤(2)中所述菌株为谷氨酸棒杆菌属 (Corynebacterium gultamicum)、大肠杆菌（Escherichia coli)、粘质沙雷菌（Serratia marcescens)、白色分枝杆菌属（My cobacterium album)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtil is)、解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、球形芽抱杆菌（Baci 1 lus sphaericus)或錯状芽抱杆菌（Bacillus cereus)及韦氏芽抱杆菌（Bacillus weihenstephanensis)〇
[0016] 优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，所述步骤(5)中以L-谷氨酸和L-异亮氨 酸为底物，利用所述步骤(3)生产的重组L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶的整细 胞为催化剂进行反应，反应初期调节PH2.0-10.0，反应总时间2-10h。
[0017] 优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，所述底物L-谷氨酸和L-异亮氨酸作为 催化底物其浓度分别为5_30g/L，重悬细胞的加入量为5-30g/L，反应温度为20°C_35°C，粗 酶利用这两种底物合成4-羟基异亮氨酸。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，操作简单，利用L-谷氨酸代替α-酮戊二酸作为 前体合成4-羟基异亮氨酸，可以在简单合成培养基中实现高密度培养，L-谷氨酸和L-异亮 氨酸的转化率分别可达到91.2 % -97.01 %和93.5 % -98.45 %。
【附图说明】
[0020]图 1 为带 6Xhis 的表达质粒 pETduet-ido-lgox。
[0021 ]图2为pETduet-ido-lgox酶切验证图，其中，M:Marker;l:ido片段；2:lgox片段；3: pETduetBamHI单酶切；4:pETduet-ido-lgoxBamHI单酶切；5:pETduet-ido-lgoxBamHI、 Hind III双酶切；6:pETduet-ido_lgox Bjl II、Xho I双酶切；7:pETduet-ido_lgox BamHI、Hind III、Bjl II、Xho I四酶切。
[0022] 图3为4-HIL标品、样品高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0024] 实施例1
[0025] 构建菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-ido_lgox并表达L-异亮氨酸-4-羟基化酶 和L-谷氨酸氧化酶，利用底物L-谷氨酸和L-异亮氨酸酶法合成4-羟基异亮氨酸
[0026] (1)获得ido和lgox核苷酸序列
[0027] 根据序列表〈400>1和〈400>2所示ido和lgox的核苷酸序列针对E.coli BL21(DE3) 进行密子优化获得序列表〈400>3和〈400>4所示核苷酸序列。ido和lgox为外源基因，为增加 其在宿主E.coli BL21(DE3)中的表达量，需对将其密码子优化为在宿主中使用频率最高的 序列，其中，
[0028] ido针对E.coli BL21(DE3)优化核苷酸序列，引物：
[0034] (2)质粒的构建
[0035] 分别用BamHI、HindIII、BglII、XhoI对pETduet进行酶切，酶切产物在l·0%琼 脂糖电泳后纯化后，用切胶回收试剂盒纯化。然后在含有Solution〗的连接体系中与经相同 酶切纯化回收获得的ido和lgox核苷酸序列在16°C进行连接反应12h;链接后的反应产物转 化宿主细胞E.coli DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆菌，在LB培养基中37°C过夜培养后提取 少量质粒进行测序验证，得到含有L-异亮氨酸-4-羟基化酶ido和L-谷氨酸氧化酶lgox基因 的质粒pETduet-ido-lgox(见图1，图2)，所得质粒pETduet-ido-lgox的序列为序列表〈400> 5所示序列。
[0036] (3)基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pETduet-ido_lgox的构建
[0037] 质粒pETduet-ido-lgox转化宿主Ε· coli BL21 (DE3)感受态细胞(所述pETduet为 商品化质粒），挑取阳性菌落，并保菌，菌名命名为E.coli BL21(DE3)/pETduet-ido_lgox。
[0038] (4)获得催化所需粗酶L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶
[0039] 将获得的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pETduet-ido_lgox以甘油菌0.1%接种 量接种至l〇〇mL含氨苄青霉素（100yg/mL)的LB液体培养基，于37°C200rpm培养12h，再按2% 接种率转接500mL含氨苄青霉素（100yg/mL)的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/ L，NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2，121。(：灭菌2011^11)，于371€200印111培养至00600 = 0.6±0.1时添 加终浓度为0.1111111〇1/11?16,32°(：诱导培养711。结束后7000印111离心5111丨11去上清，0.75% NaCl溶液洗涤菌体2次去上清，-80 °C冻存12h，即获得所需粗酶L-异亮氨酸-4-羟基化酶和 L-谷氨酸氧化酶。
[0040] (5)酶催化法合成4-羟基异亮氨酸
[0041]将获得的粗酶添加入已配制好的反应缓冲液中，终浓度为25g/L;于32°C、转速 150rpm水浴摇床催化反应4h，离心取上清，即获得产物4-羟基异亮氨酸。HPLC检测，经过4h 的催化反应，L-谷氨酸和L-异亮氨酸的转化率分别为95.42%和96.71 %。
[0042] 上述反应缓冲液配制方法:L-谷氨酸20g/L，L-异亮氨酸15g/L，Fe2+20mm〇l/L，Vc 5mmol/L，Hepes 50mmol/L，pH为7·0〇
[0043] (6)4-羟基异亮氨酸检测
[0044] 将催化反应液于8000g离心5min后取上清液，经0.8 % (V/V) 2，4-二硝基氟苯衍生 后采用高效液相色谱测定4-HIL含量，检测条件为:Agilent (：18(15111111\4.6111111，5以111)，采用 乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33°C，检测波长360nm(高效液相色谱图见图3)，根据高效 液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间对比，确定目标产物即为4-羟基异亮氨酸。
[0045]实施例2酶催化法合成4-羟基异亮氨酸
[0046]将实施例1(4)获得的粗酶添加入已配制好的反应缓冲液中，终浓度为20g/L;于30 °C、转速150rpm水浴摇床催化反应4h，离心取上清，即获得产物4-羟基异亮氨酸。HPLC检测， 经过4h的催化反应，L-谷氨酸和L-异亮氨酸的转化率分别为91.2%和93.5%。
[0047] 上述反应缓冲液配制方法:L-谷氨酸20g/L，L-异亮氨酸15g/L，Fe2+20mm 〇l/L，Vc 5mmol/L，0. lmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(配置方法为21.2g碳酸钠和67.2g碳酸氢钠溶 于水后定容至1L)，pH为9.1。
[0048]实施例3酶催化法合成4-羟基异亮氨酸
[0049]将实施例1(4)获得的粗酶添加入已配制好的反应缓冲液中，终浓度为30g/L;于32 °C、转速150rpm水浴摇床催化反应4h，离心取上清，即获得产物4-羟基异亮氨酸。HPLC检测， 经过4h的催化反应，L-谷氨酸和L-异亮氨酸的转化率分别为97.01 %和98.45%。
[0050] 上述反应缓冲液配制方法:L-谷氨酸20g/L，L-异亮氨酸15g/L，Fe2+20mm 〇l/L，Vc 5mmol/L，Hepes 50mmol/L，pH为7·0〇
[0051 ]实施例4酶催化法合成4-羟基异亮氨酸
[0052]将实施例1(4)获得的粗酶添加入已配制好的反应缓冲液中，终浓度为20g/L;于25 °C、转速150rpm水浴摇床催化反应4h，离心取上清，即获得产物4-羟基异亮氨酸。HPLC检测， 经过4h的催化反应，L-谷氨酸和L-异亮氨酸的转化率分别为92.47%和96.15%。
[0053] 上述反应缓冲液配制方法:L-谷氨酸20g/L，L-异亮氨酸15g/L，Fe2+20mm 〇l/L，Vc 5mmol/L，Hepes 50mmol/L，pH为7·0〇
[0054]上述参照【具体实施方式】对该一种4-羟基异亮氨酸的合成方法进行的详细描述，是 说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明 总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种4-羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于:使用L-谷氨酸作为催化前体酶法合 成4-羟基异亮氨酸，具体步骤如下： (1) 构建包含L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶基因重组表达载体； (2) 将步骤(1)中的重组表达载体转化所需菌株，获得基因工程重组菌株； (3) 培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧 化酶的菌体； (4) 破碎步骤(3)中的菌体，获得粗酶； (5) 将步骤(4)中获得的粗酶添加入含有L-谷氨酸和L-异亮氨酸的催化液中，利用酶法 合成4-羟基异亮氨酸。2. 根据权利要求1所述的4-羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于:步骤（1)中以序列 表〈400>1和〈400>2所示序列为已知ido和lgox原始核苷酸序列，序列表〈400>3所示序列为 idol和lgox针对E.coli BL21(DE3)密码子优化的核苷酸序列，构建得到包含L-异亮氨酸- 4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶基因的重组表达载体--质粒pETduet-ido-lgox，所得质粒 pETduet-ido-lgox的序列为序列表〈400>4所示序列。3. 根据权利要求1所述的4-羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于:步骤(2)中所述菌 株为谷氨酸棒杆菌属、大肠杆菌、粘质沙雷菌、白色分枝杆菌属、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢 杆菌或苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌或蜡状芽孢杆菌及韦氏芽孢杆菌。4. 根据权利要求1所述的4-羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于:所述步骤(5)中以 L-谷氨酸和L-异亮氨酸为底物，利用所述步骤(3)生产的重组L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶的整细胞为催化剂进行反应，反应初期调节PH2.0-10.0,反应总时间2-10h。5. 根据权利要求1所述的4-羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于:所述底物L-谷氨酸 和L-异亮氨酸作为催化底物其浓度分别为5-30g/L，重悬细胞的加入量为5-30g/L，反应温 度为20°C-35°C，粗酶利用这两种底物合成4-羟基异亮氨酸。
【文档编号】C12N15/74GK105969785SQ201610312942
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】谢希贤, 张成林, 陈宁, 麻杰, 刘涛, 徐庆阳
【申请人】天津科技大学