用于产生4-羟基-l-异亮氨酸的方法

专利名称：：用于产生4-羟基-l-异亮氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及微生物工业，并具体涉及新的双加氧酶和制备4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。
背景技术：
：4-羟基-L-异亮氨酸是能够从胡卢巴(fenugreek)种子(豆科胡卢巴(7Hgcwe〃"/oewMm-graecww丄./egww/waae))4是取禾口纟屯^f匕的一种氨基酉交。4-羟基-L-异亮氨酸显示引起强烈兴趣的促胰岛素活性，因为它的刺激作用明显依赖于介质中的血浆葡萄糖浓度，正如在离体灌注的(isolatedperfUsed)大鼠胰脏和人胰岛中所证明的(Sauvaire,Y.等，Diabetes,47:206-210,(1998》。对于磺酰脲未确认这种葡萄糖依赖性(Drucker,D.J.，Diabetes47:159-169,(1998))，磺酰脲是目前用于治疗II型糖尿病[或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDD或NIDDM)(non-insulin-dependentdiabetes(NIDD)mellitus(NIDDM))]的唯一促胰岛素药物，因此低血糖仍是磺酰脲治疗的一个普遍的、不理想的副作用(Jackson,J.和Bessler,R.Drugs,22:211—245;295-320，(1981);Jennings,A.等，DiabetesCare:12:203-208,(1989))。葡萄糖耐受的改善也是已知的(Am.J.Physiol.Endocrinol.:Vol.287,E463-E471,2004)。已经报道了这种葡糖代谢增强活性，和它用于药物和保健食品的潜在应用(特开平6-157302,US2007-000463A1)。仅存在于植物中的4-幾基-L-异亮氨酸，由于它的特殊似l夷岛素作用，可能被认为是新的促分泌素，对于治疗II型糖尿病具有潜在的重要性，所述II型糖尿病是一种特征在于与不同程度胰岛素抗性相关的缺陷性胰岛素分泌的疾病(Broca，C.等,Am.J.Physiol.277(Endocrinol.Metab.40):E617画E623，(1999》。一种通过利用胡卢巴^是取物中的双加氧酶活性将4^、抗坏血酸、2-酮戊二酸(2-oxyglutaricacid)和氧依赖性异亮氨酸氧化的方法，作为制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法已有报道(Phytochemistry,Vol.44,No.4,pp.563-566,1997)。然而，这种方法作为制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法并不令人满意，因为在20mM及以上的异亮氨酸浓度，所述酶的活性受到底物的抑制，该酶尚未得到鉴定，该酶源自植物提取物并且不易大量获得，并且该酶不稳定。已经公开了一种有效的光学纯(opticallypure)pS^R，4S)"4-羟基异亮氨酸的八步合成，其总产率为39%。这种合成的关键步骤涉及用白地霉(GeoWc/7wwcaw/Wwm)将乙基2-曱基乙酰乙酸生物转化为乙基(2S,3S)-2-曱基—3-羟基—丁酸酯和不对称Strecker合成(Wang,Q.等,Eur.J.Org.Chem.,834-839(2002))。还公开了(2S,3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的一种完全控制立体化学(totalcontrolofstereochemistry)的简短六步化学酶促合成，最后的步骤是通过使用商业上可以获得的固定在EupergitC(E-PAC)上的青霉素酰化酶G(penicillinacylaseG)水解N-苯乙酰内酯衍生物的酶促溶解(Rolland-Fulcrand,V.等，J.Org,Chem.，873-877(2004))。但在目前，尚未报道对任何L-异亮氨酸双加氧酶的克隆和通过使用L-异亮氨酸双加氧酶直接酶促羟化L-异亮氨酸来产生(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。至于由微生物产生异亮氨酸类似物，已报道了通过芽孢杆菌属(Sfl"〃w)细菌产生2-氨基-3-酮-4-曱基戊酸(AMKP)(BioorganicChemistry,Vol.6,pp.263-271(1977))。然而，没有关于源自微生物的异亮氨酸轻化酶的报道。发明概述本发明的一个目的是提供通过使用源自微生物的酶来产生4-羟基异亮氨酸(用于表示包括它的游离形式和盐形式两者，并且可称作"4HIL",下同)的方法，该方法能够以大量制备4-羟基异亮氨酸。本发明的目的包括提供具有从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的酶活性的微生物，和基于使用源自微生物的酶的羟化反应从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的方法。上述目的通过发现具有从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的酶活性的微生物来实现。本发明的一个目的是提高(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸(用于表示包括它的游离形式和盐形式两种，并且可称作"(2S，3R,4S)-4HIL"，下同)的产生，提供通过使用L-异亮氨酸双加氧酶或具有所述L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌直接酶促羟化L-异亮氨酸来制备(2S,3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。考虑前述问题而进行了大量研究，结果，本发明的发明人从自然界分离了一种具有高水平L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌，克隆了编码该L-异亮氨酸双加氧酶的基因，并且发现了该L-异亮氨酸双加氧酶可优选用于合成期望的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，由此完成了本发明。也就是说，本发明的目的包括提供新的L-异亮氨酸双加氧酶和编码该L-异亮氨酸双加氧酶的DNA,以及使用该L-异亮氨酸双加氧酶产生(2S,3R,4S)-4-轻基-L-异亮氨酸的方法。上述目的通过发现本发明的新L-异亮氨酸双加氧酶而实i见。在下文中将详细描述本发明。本发明的一个目的是提供产生4-羟基异亮氨酸及其盐的方法，其包括通过如下产生4-羟基异亮氨酸的步骤在源自微生物的羟化酶存在下对异亮氨酸或其盐进行羟化反应，并从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述微生物是属于芽孢杆菌属的微生物。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述属于芽孢杆菌属的微生物是选自苏云金芽孢杆菌(Bo"7/wAwnV^'e"^)、地衣芽孢杆菌C6(3c/〃ws//c/zewy^m&)、3求形芽孑包才干菌(6a"7/w5s//zaen-CMS)、蜡^)犬芽孑包4干菌(Bac/〃wscerew力和韦氏芽孑包杆菌(5ac/〃wswez77erafe;/z"wem^)的孩i生物。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述羟化反应在制备自对数生长期微生物细胞的细胞裂解物存在下进行。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中对L-异亮氨酸进4亍羟卩t反应。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述羟化酶是双力口氧酶。本发明进一步的目的是"l是供如上所述的产生方法，其中所述羟化酶具有以下特性(a)需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b)最适反应pH为5-8，(c)最适反应温度为45°C或更低，(d)在50。C或更高失活，(e)受到EDTA、012+和Zn2+抑制。本发明进一步的目的是提供具有以下特性并且可以从芽孢杆菌属细菌分离的双加氧酶(a)需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b)最适反应pH为5-8,(c)最适反应温度为45。C或更低，(d)在50。C或更高失活，(e)受到EDTA、Qj2+和Zn2+抑制，(f)如通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量，包含分子量为29000士2000的亚基，(g)在N末端具有SEQIDNO:5的氨基酸序列。本发明进一步的目的是提供如上所述的双加氧酶，其中所述芽孢杆菌属细菌是苏云金芽孢杆菌。本发明进一步的目的是提供选自下组的DNA:(a)包含SEQIDNo:l的核普酸序列的DNA;(b)与具有SEQIDNo:l核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严紧条件下杂交、并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA;(c)编码包含SEQIDNo:2的氨基,列的蛋白质的DNA;(d)编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位(inversion);和(e)编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA,所述氨基S^列与SEQIDNo:2的氨基S^f列是至少98%同源的。本发明进一步的目的是提供通过如下获得的重组DNA:将包含上述DNA的DNA(theDNAcontainingthesame)与载体DNA连4妄。本发明进一步的目的是提供由包含上述重组DNA的重组DNA(therecombinantDNAcontainingthesame)寿争4b的纟田月包。本发明进一步的目的是提供用于产生具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的方法，其包括在培养基中培养包含所述重组DNA的细胞，和在培养基和/或细胞中积累具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。本发明进一步的目的是提供选自下组的蛋白质(f)包含SEQIDNo:2的氨基酸序列的蛋白质；(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(h)与SEQIDNo:2的氨基酸序列至少98%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。本发明进一步的目的是提供一种蛋白质，其包含(A)具有催化通过L-异亮氨酸的羟化产生(2S,3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的反应的活性；(B)所述活性依赖于二价阳离子Fe2,并且(C)如通过SDS-PAGE测量，每个亚基的分子量是约29±2.0kDa。本发明进一步的目的是提供用于制备(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，包括步骤在选自下组的至少一种L-异亮氨酸双加氧酶存在下，使L-异亮氨酸在水性溶剂(aqueoussolvent)中反应(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基Sl^列的蛋白质，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)与SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质；分离产生的(2S，3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。本发明进一步的目的是提供用于制备(2S,3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，包括步骤在包含选自下组的L-异亮氨酸双加氧酶的细菌存在下，使L-异亮氨酸在水性溶剂中反应(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列的蛋白质，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)与SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质；和分离产生的(2S，3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌被修饰以增强L-异亮氨酸双加氧酶的活性。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中通过增加L-异亮氨酸双加氧酶的表达来增强所述L-异亮氨酸双加氧酶的活性。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中通过修饰编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达调控序列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的拷贝数来增加所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(E!sc/zen'c/z/a)、j艮单月包菌属(i^ewfifcwww(3s)、才奉杆菌属(C07we6acfeWwm)、节杆菌属(^W/2ra6acfer)、曲霉属(y^/erg7'〃w力或芽孢杆菌属。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于大肠杆菌(￡^c/zen,c/z/aco/z〕、筒单节一干菌(^W/zroZacterw'w//ex)、谷氛酉交才奉牙干菌(Cwywe6acfen,w附g/wtomz'cwm)、3求形节4干菌(/lW/2ro6actorg7o6^/brm/力、石危石黄节4干菌(^^/^(60^07-w^/rew力、粘液节^干菌(v4rf/zra6actorv&cosM力或才古草芽孑包本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌是细菌培养物、细月包、经处理的细胞(treatedcells)或细胞裂解物。附图简述图1显示的图示展现了菌株2-e-2的培养物中4-羟基异亮氨酸和AMKP的产生量随时间的变化。图2显示的图示展现了菌抹2-e-2的培养物中浊度的变化。图3显示的图示展现了通过使用菌林2-e-2的静息细胞观察的产生4-羟基异亮氨酸和AMKP的活性。图4显示的图示展现了多种样品的4-羟基异亮氨酸产生活性。图5显示的图示展现了菌抹2-e-2细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生活性的pH依赖性。图6显示的图示展现了菌抹2-e-2细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度依赖性。图7显示的图示展现了菌抹2-e-2细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度稳定性。图8显示的图示展现了纯化酶的4-羟基异亮氨酸产生活性的pH依赖性。图9显示的图示展现了纯化酶的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度依赖性。图IO显示的图示展现了纯化酶的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度稳定性。图11显示本发明产生IDO的方法的流程图(flowchart)。图12显示从苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2纯化IDO(照片)。描绘了来自纯化步骤的蛋白质制备物的SDS-PAGE。泳道1-指示分子量的标记；2-粗制细胞裂解物；3-^L酸铵沉淀；4-SEC;5-AEC。图13显示来自苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2的IDO的MS鉴定。图14显示苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型(serovarisraelensis)，ATCC35646)RBTH—06809ORF的推定的翻译起点。图15显示重组pMW119-IDO(Lys,32/23)质粒的人工表达模块(module)。图16显示pMW119-IDO(Lys，23)质粒的物理图谱和克隆的包含IDO结构基因的5am//I-&cI片段的测定的DNA序列。灰色标记的调节区中的自发点突变。图17显示pMW119-IDO(Lys,32)质粒的物理图谱和克隆的包含IDO结构基因的^W7州-SacI片^殳测定的DNA序列。图18显示对应于IDO(Lys,23)、IDO(Lys,32)和RBTH—6809(5'端截短的)的结构基因的DNA比对。用灰色标记可变的位置。图19显示IDO(Lys,23)、IDO(Lys，32)和RBTH—06890ORF的蛋白质比对。用该灰色标记可变的位置。图20显示来自苏云金芽孢杆菌的IDO、来自蜡状芽孢杆菌的BC1061和来自韦氏芽孢杆菌的保守的假设蛋白的蛋白质比对。实施发明的最佳方式在本说明书中，4-羟基异亮氨酸意指选自下组的非对映异构体中的一种类型、或者两种或更多种类型的混合物(2S，3S，4S)-4-羟基异亮氨酸、(2S,3R,4R)-4-羟基异亮氨酸、(2S，3S，4R)-4-羟基异亮氨酸和(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸。4-羟基异亮氨酸优选是(2S，3R，4S)-或(2R,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，或它们的混合物，更优选是(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸。具体而言，术语"(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸'，或"(2S,3R，4S)-4HIL"可以指单一化合物或含有(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的混合物。术语"细菌，，或"微生物"如用于本说明书中包括产酶的细菌或微生物、存在或增强了目标酶活性的这些细菌或微生物的突变体和遗传重组体等。O从异亮氨酸产生4HIL的酶活性作为本发明基于羟化酶催化的异亮氨酸羟化反应来产生4-羟基异亮氨酸的方法中使用的羟化酶，可以使用任何粗制酶如樣i生物培养物、细菌细胞或细胞裂解物或纯化酶，只要所选材料具有将异亮氨酸转化为4-羟基异亮氨酸的酶活性。粗制酶如破裂的细胞或纯化的酶是理想的。羟化酶的实例包括加氧酶、双加氧酶等，并且优选是双加氧酶。能够从菌抹2-e-2分离并且具有以下特性的羟化酶是优选的(a)需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b)最适反应pH为5-8，(c)最适反应温度为45°C或更低，(d)在50。C或更高失活，(e)受到EDTA、Cu2+和Zn2+抑制。能够从菌抹2-e-2分离的羟化酶进一步具有以下特性(f)如通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测量，由分子量为29000±2000的亚基组成，(g)在N末端具有SEQIDNO:5的氨基酸序列。当羟化酶需要辅因子时，优选向体系添加或供应所述辅因子。用于双加氧酶的辅因子的实例包括，例如，Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸。当它们形成盐时，可将这些辅因子以它们的盐的形式添加或供应至体系。作为所述微生物，可以使用任何微生物，只要选择的是在所述羟化反应条件下具有将异亮氨酸转化成4-羟基异亮氨酸的酶活性的微生物。使用的微生物的实例包括属于芽孢杆菌属或假单胞菌属的微生物，它们的突变体或衍生物，等等。另外，所述微生物可以是这样的微生物，其中通过基因重组技术表达所述的羟化酶，并且所述微生物具有4-羟基异亮氨酸产生活性。具体实例包括苏云金芽孢杆菌(菌抹2-e-2、菌林AKU238、菌林NBRC3958、菌株ATCC35646等)、地衣芽孢杆菌(菌抹AKU223、菌抹IAM11054等)、球形芽孢杆菌(菌林AKU227、菌林NBRC3526等)、蜡状芽孢杆菌菌株ATCC14579和韦氏芽孢杆菌菌抹KBAB4。将菌抹2-e-2命名为AJ110584菌抹，并根据布达佩斯条约规定在2006年9月27日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(independentadministrativeagency,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,InternationalPatentOrganismDepositary)(TsukubaCentral6，1-1，Higashi1-Chome,Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566,Japan),并获得登录号FERMBP-10688。在上述微生物中，菌林名称以AKU起始的那些能够从LaboratoryofFermentationPhysiologyandAppliedMicrobiology,DivisionofAppliedLifeSciences,GraduateSchoolofAgriculture,KyotoUniversity(京都大学农业科学院应用生命科学部发酵生理学和应用微生物学实验室)获得。菌林名称以IAM起始的那些子果存在LaboratoryofBioresources,InstituteofMolecularandCellularBiosciences,theUniversityofTokyo(东京大学分子和细胞生物科学研究所生物资源实验室)的IAM培养物保藏中心，并且可以通过使用登记号来获得。与所述菌抹对应的登记号在IAM目录(IAMCatalogueofStrainsThirdEdition(IAM菌抹目录第三版)，2004)中列出。菌抹名称以NBRC起始的那些能够从独立行3支；去人产品^平i"介4支术基石出片几#勾(independentadministrativeagency,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)(2画5-8，KazusaKamatari，Kisarazu-shi，Chiba,292-0818)获得。菌抹名称以ATCC起始的那些能够从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(邮政地址ATCC，P.O.Box1549,Manassas,VA20108，1,UnitedStatesofAmerica)。韦氏芽孢杆菌菌抹KBAB4能够从法国国家农业研究院(InstitutNationaldelaRechercheAgronomique)(由卩3支i也iit:GenetiqueMicrobienne，INRA,DomainedeVilvert,79352JouyenJosascedex,France)获得。苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2是由本发明的发明人从京都市的土壤中新近分离的一种菌抹，该菌抹的科学特性示于下文。苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2的分类学特性1.表型细胞形态芽孢杆菌(大小1.0-1.2x2.0-3.0|im)革兰氏染色+内生孑包子(endospore):+对氧的态度需氧生长温度在20-35。C生长良好(favorablegrowth)最优pH:pH7.0-7.52.基于16SrDNA核苷酸序列的分子系统进化(phylogenetic)分析通过使用BLAST在细菌类型菌株数据库(NCIMBJapan,Shizuoka(静冈》和国际核苷S饼列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)中搜索与菌林2-e-2的16SrDNA核苷酸序列(SEQIDNO:9)的同源性，各检索到30个最同源的菌抹。然后，使用从细菌类型菌林数据库检索到的30个最同源菌抹和根据邻接法的各种样本的16SrDNA核苷酸序列来创建分子系统进化树。对于同源性检索和生成筒化的分子系统进化树，孑吏用DNAsisPro(HitachiSoftwareEngineeringCo.,Ltd.,Tokyo)。使用BLAST对细菌类型菌抹数据库进行同源性搜索的结果是，菌抹2-e-2的16SrDNA的部分核苷酸序列与苏云金芽孢杆菌ATCC10792菌抹的16SrDNA以100%的同源性匹配。对GenBank/DDBJ/EMBL进行同源性搜索的结果是，菌林2-e-2的16SrDNA与苏云金芽孢杆菌的显示高同源性。另外，使用菌林2-e-2的16SrDNA和从细菌类型菌抹数据库检索到的30个最同源菌抹的16SrDNA的简化分子系统进化分析的结果是，菌抹2-e-2与苏云金芽孢杆菌的16SrDNA形成了基本上相同的系统进化分支，说明它们是非常紧密相关的。3.分类和鉴定的结果简化的形态学观察的结果是，菌抹2-e-2显示了芽孢杆菌属细菌的共有特性，并且对部分16SrDNA序列的分析结果也显示菌抹2-e-2属于苏云金芽孢杆菌。由于没有发现微生物与菌抹2-e-2显示出同样水平的AMKP产生活性，所以将这种菌林鉴定为新菌林。本发明中使用的微生物可以根据常规培养方法培养。天然培养基或合成培养基均可用于培养，只要所述培养基含有能由所述微生物同化的碳源、氮源、无机盐等，并且在该培养基中能够有效地培养所述微生物。碳源可以是能由所述微生物同化的碳源，并且可以使用糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、淀粉水解物和糖蜜，有机酸如乙酸、乳酸和葡糖酸，以及醇如乙醇和丙醇。作为氮源，可以使用氨、各种无机酸和有机酸的铵盐如硫酸铵、氯化铵、醋酸铵和磷酸铵、其它含氮化合物、胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粉、大豆粉水解物、各种发酵细胞及其消化产物等，只要所述微生物能够同化它们。作为无机盐，可以使用磷酸钾、硫酸铵、氯化铵、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰等，只要使用的微生物能够同化它们。此外，4丐盐、锌盐、硼盐、铜盐、钴盐、钼盐等可以作为痕量元素添加。另外，维生素如硫胺素和生物素，氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸，核酸相关物质如腺噤呤和鸟嘌呤等可以根据需要添加。培养在有氧条件下进行，如通过振荡培养物或深通气搅拌培养物(deepaerationstirringculture)而获得的条件。培养温度优选10-37。C，培养时间是5-40小时。在培养过程中将培养物的pH保持在5.0-9.0。通过使用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钓、氨等来调节pH。本发明中使用的粗制酶如破裂的细胞，即微生物细胞裂解物，可为包含胞外羟化酶的粗制酶，它的实例包括用表面活性剂、有机溶剂或酶处理的细菌细胞，经过超声、机械破裂或溶剂处理的细胞，细胞蛋白级分，经处理细胞的固化产物，等等。所述细胞裂解物优选制备自对数生长期的细胞。为了制备细胞裂解物，可以将培养的细菌细胞用等渗溶液如生理盐水洗涤，然后通过任意手段使其破裂，例如，使用弗氏压碎器(Frenchpress)、玻璃珠、超声破碎仪(ultrasonicdisruptor)、MantonGaulin均质仪、研砵(mortar)或它们的组合等的挤压破裂。为了进一步有效的破裂，可以通过冷冻处理、酶处理等以物理或化学方法处理细胞膜表面。在细胞破裂期间，使细胞总是保持在低温，并且当细胞裂解温度因破裂处理升高时，可以立即将温度降低。用于细胞裂解物的水性介质的实例包括，但不限于，水和緩冲液如硼酸盐、醋酸盐、碳酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐的緩沖液和Good緩沖液。另外，可以添加甘油、DTT等作为酶稳定剂，而且可以添加EDTA、EGTA、PMSF、胃蛋白酶抑制剂、E-64等作为蛋白酶抑制剂。也可添加抑制剂的组合、抑制剂混合物(inhibitorcocktail)等。关于使用上述细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生反应的底物溶液的组成，可以使用体积为100(il的含有5mM异亮氨酸、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和5mMFe"的100mMHEPES緩冲液(pH7.0)，并且将反应在30。C进行60分钟。除了HEPES緩冲液，也可以使用任意緩冲液如MES缓冲液和GTA广域緩沖液(GTAwiderangebuffer)。根据需要将酶失活之后，将反应溶液的离心上清级分过滤，并通过高效液相层析或TLC来确认4-羟基异亮氨酸的产生。可以通过任何方法来定量4-羟基异亮氨酸，只要使用了能够将4-羟基异亮氨酸与其它成分分离的分析系统，并且所述分析系统的实例包括TLC和高效液相层析。在它们之中，高效液相层析优选用于定量分析，原因是它的高灵敏度和高分离能力。实例包括MJ交分析方法WatersAccQ-TagTM法，等等。通过改进的WatersAccQ-TagTM法(参见下文描述的实施例)，能够分离4-羟基异亮氨酸的非对映异构体们，并且能够分离天然存在的4-羟基异亮氨酸和2-氨基-3-曱基-4-酮戊酸(一种通过氧化4-羟基异亮氨酸的羟基形成的酮类化合物)。根据本发明产生的4-羟基异亮氨酸可以通过使用常规采用的氨基酸纯化方法来分离。例如，通过使用离子交换树脂处理、膜处理、结晶等的組合，可以将4-羟基异亮氨酸自反应混合物的上清(通过离心从中去除固体)分离。在本发明的产生方法中，用于异亮氨酸羟化反应的pH优选是5-8。关于反应混合物的组成，优选在所述混合物中存在对酶反应关键的因子。当Fe"是关键因子时，期望反应混合物组成不太可能引起与Fe"的螯合，如HEPES緩沖液、MES緩冲液和GTA广域緩冲液。然而，对反应混合物组成根本无限制，只要保持Fe^的作用即可。在本发明的产生方法中，用于异亮氨酸羟化反应的温度通常是15-30。C，优选45。C或更低。反应时间通常是5分钟至200小时，尽管它依赖于酶量变化。作为用于羟化反应的异亮氨酸，优选使用L-异亮氨酸。在其中进行反应的溶剂的实例包括水性溶剂，例如，水，緩冲液如碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、种檬酸盐和Tris的緩冲液，有机溶剂，例如，醇如曱醇和乙醇，酯如乙酸乙酯，酮如丙酮，酰胺如乙酰胺，含有这些有机溶剂的水性溶剂，等等。另外，可以根据需要添加用于激活羟化反应的因子。本发明中使用的微生物细胞裂解物的蛋白浓度是0.1-50mg/ml，优选0.5-20mg/ml(按照细胞重量(湿重))。4-羟基-L-异亮氨酸可以通过如下产生向水性介质以合适的浓度添加细胞裂解物、底物和辅因子，并且使所述反应在45。C或更低的温度，优选30。C,和pH5-12，优选pH5-7.5进行5分钟至120小时。<11>L-异亮氨酸双加氧酶和编码该L-异亮氨酸双加氧酶的DNA和它们的用途以下参考附图提供关于[I]L-异亮氨酸双加氧酶，[II]使用本发明的L-异亮氨酸双加氧酶产生(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的方法的详细说明。[I]L-异亮氨酸双加氧酶根据本发明发明人的研究，确认了芽孢杆菌属中的细菌菌抹包含具有形成(2S，3R,4S)-4HIL能力的L-异亮氨酸双加氧酶。在下文将来自微生物细胞的L-异亮氨酸双加氧酶缩写为IDO。如上所述，本发明的发明人提供的对环境微生物的筛选揭示了独特的微生物苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2具有能够催化从L-异亮氨酸(用于表示包括它的游离形式和盐形式两种，下同)直接形成(2S,3R,4S)-4HIL的反应的活性。亮氨酸双加氧酶，在下文缩写为IDO(Lys，23)。另外，本发明的发明人通过纯化源自苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2的双加氧酶确定了IDO(Lys，23)的>^-末端#^酸序列。将苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2命名为苏云金芽孢杆菌AJ110584，并根据布达佩斯条约规定在2006年9月27曰保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(Central6，1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki305-8566，Japan)并获得登录号FERMBP-10688。另外，本发明的发明人还合成了从IDO(Lys，23)的氨基酸序列推定的约30个碱基对的DNA分子，使用来自苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2的染色体DNA和下文缩写为IDO(Lys，23)的来自苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌抹(ATCC35646)的L-异亮氨酸双加氧酶作为对照分离并获得了编码IDO(Lys,23)的DNA的全长，构建了重组质粒并用它们转化了大肠杆菌菌林的细胞。对重组大肠杆菌IDO活性的后续分析揭示了与IDO(Lys,32)相比高得多(5倍高)的IDO(Lys,23)活性，原因是来自苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2的IDO(Lys，23)基因中的独特突变。中的SEQIDNo:1。此外，由SEQIDNo:1的核苦酸序列编码的IDO(Lys，23)的氨基酸序列示于SEQIDNo:2。SEQIDNo:2是由SEQIDNo:1的核苷酸序列编码的IDO(Lys,23)的氨基酉拼歹'j。SEQIDNO:2的IDO(Lys，23)具有L-异亮氨酸双加氧酶活性，并且催化从一个分子的L-异亮氨酸直接合成下文式(1)中所示(2S,3R，4S)-4HIL的反应。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其次，依次提供关于(l)编码L-异亮氨酸双加氧酶的DNA，p)L-异亮氨酸双加氧酶的特性和(3)用于产生L-异亮氨酸双加氧酶的方法。(l)编码L-异亮氨酸双加氧酶的DNA具有SEQIDNo:1的核香酉lL^列的本发明的IDO(Lys,23)基因分离自实施例部分描述的苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2的染色体DNA。编码IDO(Lys,23)的、来自苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2的SEQIDNo:1的核苷S交序列显示与苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌株(ATCC35646)基因组核苷S吏序列无注释的部分(non-annotatedpart)在核苷酉饼歹'j(图19)和tt,歹'j(图18)中的高水平同源性，其中之一在2007年1月17日提交至NationalCenterforBiotechnologyInformation(美国国家生物信息中心)，NIH(美国国家卫生研究所)，Bethesda,MD20894,USA(登录号AAJM00000000.1,GI:74494335)，另一个获得自相同苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌抹的编码IDO(Lys,32)的基因组DNA的测序结果，所述苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌抹以登录号VKPMB-197由俄罗斯国立工业微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM)得到。来自苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌抹VKPMB-197的编码IDO(Lys，32)的核苷S交序列示于SEQIDNO:7。下文将提供关于从产IDO细菌获得IDO氨基酸序列的方法的说明。从凝胶回收主要蛋白并通过MS分析鉴定为来自苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)ATCC35646菌林的推定的RBTH_06809蛋白(图l3)。对提取自SDS-PAGE的蛋白样品进行了质谱分析。根据Govorun,V.M.等(Theproteomecomparativeanalysisof7/e//coZ""erclinicalisolates.Biochemistry(Rus)，68，42_49pO(B))的规程进行凝胶处理、胰蛋白酶水解(trypsinolysis)、蛋白质提取和通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)的质量分析。使用Mascot软件(MatrixScience,USA)的PeptideFingerprint(肽指紋)选项通过成组的蛋白质的光解肽质量来鉴定该蛋白质。能够使用基于苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌抹(ATCC"6M)的序列设计的适当引物通过PCR来获得编码IDO的DNA片段。用于PCR的方法在公开文献如White,T丄等，TrendsGenet.5,185(1989)中描述。用于分离染色体DNA的方法，以及使用DNA分子作为探针从基因文库分离期望的DNA分子的方法，在公开文献如MolecularCloning,3rdedition(第3版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)中描述。用于测定编码IDO的分离的DNA核苷酸序列的方法在APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWiley&Sons,Inc.(1985)中描述。另外，可以通过使用由AppliedBiosystems制造的DNA测序仪来测定核苷酸序列。源自苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2的编码IDO(Lys，23)的DNA示于SEQIDNo:1。来自苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌株VKPMB-197的编码IDO(Lys,32)的核普酸序列示于SEQIDNo:7。催化从L-异亮氨酸形成(2S,3R,4S)-4HIL的反应的IDO的编码DNA不仅仅是SEQIDNo:1中所示的DNA。这是因为在形成催化从L-异亮氨酸产生(2S,3R，4S)-4HIL的反应的IDO的芽孢杆菌属菌种中，从各个菌种和菌抹观察到的核苷il/f列中应该存在差异。本发明的DNA不仅包括编码IDO的分离的DNA,本发明的DNA中还包括向分离自产IDO孩i生物染色体DNA的编码IDO的DNA人工添加了突变的DNA，只要该DNA编码具有催化所述反应的活性的IDO。用于人工添加突变的方法包括通常使用的方法，如Method,inEnzymol.,154(1987)中描述的用于导入位点特异性突变的方法。在严紧条件下与具有SEQIDNo:1核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA杂交、并且编码具有IDO活性的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA中。如用于本文，"严紧条件"指这样的条件，在该条件下形成特异性杂合体而不形成非特异性的杂合体。尽管难以明确地用数字表示这些条件，但作为示例，值得一提的是以下条件在该条件下同源性高于例如优选70%或更高、更优选80%或更高、还更优选90%或更高、并且尤其优选95%或更高同源性的DNA分子相互杂交，而具有较低同源性的DNA分子不相互杂交；或者在该条件下，在Southern杂交的常规洗涤条件下产生杂交，所述常规条件即盐浓度相当于O.lxSSC和0.1%SDS在37°C,优选O.lxSSC和0.1°/。SDS在60°C，并更优选O.lxSSC和0.1%SDS在65。C。〗笨针长度可以依赖于杂交条件合适地选择，并且通常在100bp至1kbp变化。另外，"L-异亮氨酸双加氧酶活性，，对于从L-异亮氨酸合成(2S,3R，4S)-4HIL的活性可能是足够的。然而，在核苷酸序列在严紧条件下与SEQIDNo:l核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交的情况下，优选在37°C和pH8条件下保留具有SEQIDNo:2氨基酸序列的蛋白质的L-异亮氨酸双加氧酶活性的10%或更多，优选30%或更多，更优选50%或更多，并且还更优选70%或更多。另夕卜，编码基本上与由SEQIDNo:1的DNA编码的IDO相同的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA中。即，以下DNA也包括在本发明的DNA中(a)包含SEQIDNo:1的核香酸序列的DNA;(b)在严紧条件下与具有SEQIDNo:1核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA杂交并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA;(c)编码包含SEQIDNo:2的氨基酸序列的蛋白质的DNA;(d)编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA，所述4J^酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(e)编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA，所述氨基酸序列与SEQIDNo:2的氨基酸序列是至少70%同源的，优选至少80%同源的，更优选至少90%同源的，并且还更优选至少95%同源的。在此，"一个或几个"指蛋白质氨基酸残基的3D结构或L-异亮氨酸双加氧酶活性不受显著损坏的范围，更具体而言，范围是1-78,优选1-52，更优选1-26,并且还更优选1-13。一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位应该是保守的突变以便保留活性。代表性的保守突变是保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys,用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取孑义Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取4戈Glu,用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile,用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met,用Trp、Tyr、Met、lie或Leu取代Phe,用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr,用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。另外，"L-异亮氨酸双加氧酶活性"指如上所述从L-异亮氨酸合成(2S，3R,4S)-4HIL的活性。然而，在氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基S吏序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的情况下，优选在30。C和pH6.0的条件下保留具有SEQIDNo:2的氨基酸序列的蛋白质L-异亮氨酸双加氧酶活性的10%或更多，优选30%或更多，更优选50%或更多，并且还更优选70%或更多。本发明的IDO的L-异亮氨酸双加氧酶活性可以通过使用高效液相层析(HPLC)分析(2S，3R，4S)-4HIL从L-异亮氨酸的形成来测量。另夕卜，SEQIDNO:1的同源物DNA可以用作本发明的编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因。同源物基因是否编码L-异亮氨酸双加氧酶能够通过测量细胞裂解物或过表达所述同源物DNA的微生物的细胞裂解物的L-异亮氨酸双加氧酶活性来确认。SEQIDNO:1的同源物DNA也可以作为本发明的L-异亮氨酸双加氧酶从另外的芽孢杆菌属菌种(例如，蜡状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌)的基因组制备。蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌的氨基酸序列的比对示于图20，而芽孢杆菌属之间的保守序列示于SEQIDNO:6。另外，可以基于与来自芽孢杆菌属(5""7/w)、埃希氏菌属、棒杆菌属、节杆菌属、曲霉属、假单胞菌属、颗粒杆菌属(Gra柳/沾acter)、曱基菌属0W^/^/o6ad〃M力、茅贞^i4干菌属(GWmw/沾acfer)、p耆酉臾菌属04c/力)/n7/MW)、农4干菌属(v4gra6a"en'wm)、葡一唐4干菌属(G7"cowo6ac/er)、才丙一干菌属(Caw/c^<3cter)、才示才庄菌属(5Wgmate〃a)、净'占3求菌属(^Vfyx:ococc附)、尸o/aro附o"os、才丙4干菌属(Caw/okifcfer)、尸o/ara附o"05、鞘氨醇单月包菌属(iS^/zz'"gomoww)、食酸菌属(v4cWovorax)、分才支一干菌属(A^co6acfen'wm)、固氮菌属(ylzoto6(3cte。、《瓜菌属(M》/0)、多核杆菌属(尸o/，wc/eo/)a"e。、链霉菌属(5yre/toWFe力等的下列基因(表l)的同源性，通过克隆获得来自其它细菌的编码同源物DNA。可以使用例如SEQIDNO:3和4中所示的合成寡核苷酸通过PCR扩增所述同源物。表1.推定的编码L-异亮氨酸双加氧酶的DNA列表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(2)IDO的特性其次，提供关于源自苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2的、纯化的L-异亮氨酸双加氧酶(IDO(Lys,23))特性的说明。本发明的IDO(Lys,23)具有SEQIDNo:2的氨基酸序列，如通过前文描述的基因分离和分析所清楚确定的。然而，本发明包括具有如下氨基酉l/f列并且也具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、在夹失、插入、添加或倒位。即，本发明的IDO包括以下蛋白质(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列的蛋白质；(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基S交序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(h)与SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源、优选至少80%同源、更优选至少90%同源、并且还更优选至少95同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。在此，"几个，，和"L-异亮氨酸双加氧酶活性，，的定义与部分(l)编码L-异亮氨酸双加氧酶的DNA中的定义相同。本发明的IDO催化从L-异亮氨酸通过羟化反应合成(2S，3R,4S)-4HIL的反应。本发明的IDO的L-异亮氨酸双加氧酶活性可以通过使用高效液相层析(HPLC)分析(2S,3R，4S)-4HIL从L-异亮氨酸的形成来测量。本发明的IDO能够催化从L-异亮氨酸通过羟化反应合成(2S，3R,4S)-4HIL的反应。在双加氧酶催化的羟化反应中，分子氧的一个原子被纳入L-异亮氨酸，而另一个氧原子纳入其它氧受体，例如a-酮戊二酸，导致形成(2S，3R,4S)-4HIL和琥珀酸并释放二氧化碳。双加氧酶能够以立体特异性的方式羟化脂肪族碳链。尽管迄今为止已经报导了能够催化L-异亮氨酸作为底物的羟化反应的植物酶的一个实例，所述植物酶由源自胡卢巴提取物的L-异亮氨酸双加氧酶组成(Phytochemistry,Vol.44，No.4,pp.563-566，1997)。但是，这种方法作为制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法并不令人满意，因为在20mM及以上的异亮氨酸浓度所述酶的活性受到底物的抑制，所述酶未经鉴定，所述酶源自植物提取物并且不易大量获得，并且所述酶不稳定。其后，下文将提供针对純化IDO(Lys,23)调查的酶特性的描述。IDO(Lys,23)催化下面所示反应中L-异亮氨酸十a-酮戊二酸+02^4HIL+琥珀酸+C02从L-异亮氨酸形成由以下通式(I)代表的(2S,3R,4S)-4HIL的反应因此，通过使用本发明的IDO(Lys,23)从L-异亮氨酸产生(2S,3R,4S)-4HIL的方法也属于本发明。另外，本发明的IDO(Lys,23)的活性严格依赖于二价阳离子Fe^并且在EDTA存在下完全封闭。IDO(Lys，23)能够催化将一个氧原子转移至L-异亮氨酸并且将另一个氧原子转移至作为受体分子的a-酮戊二酸。所以，IDO(Lys，23)可能属于a-酮戊二酸(a-ketoglutamate)依赖性双加氧酶。由于通过SDS-PAGE测得的IDO(Lys,23)每个亚基的分子量是约29±2.0kDa。因此，本发明还包括由以下特征限定的蛋白质(A)具有催化从L-异亮氨酸和a-酮戊二酸产生(2S,3R,4S)-4HIL的反应的活性；(B)所述活性依赖于二价阳离子包括Fe2、并且(C)如通过SDS-PAGE测量，每个亚基的分子量是约29±2.0kDa。来自苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)菌抹VKPMB-197的IDO(Lys,32)具有SEQIDNO:8的氨基S臾序列。(3)用于产生L-异亮氨酸双加氧酶的方法接下来，提供关于产生本发明IDO的方法的说明。有两种方法来产生本发明的IDO。这两种方法由(i)培养产IDO的孩i生物以形成和积累IDO的方法，和(ii)通过重组DNA技术制备形成IDO的转化体，并且培养所述转化体来积累IDO的方法组成。(i)通过微生物培养形成和积累IDO的方法在通过培养产IDO微生物来形成和积累IDO的方法中充当获得IDO的来源的微生物实例包括属于埃希氏菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、曲霉属或芽孢杆菌属的微生物。属于芽孢杆菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、节杆菌属、曲霉属、假单胞菌属、颗粒杆菌属、曱基菌属、颗粒杆菌属、嗜酸菌属、农杆菌属、葡糖杆菌属、柄杆菌属、标桩菌属、粘球菌属、尸o/ara附owos、柄杆菌属、尸o/"ramowos、鞘氨醇单胞菌属、食酸菌属、分枝杆菌属、固氮菌属、弧菌属、多核杆菌属、链霉菌属的任何微生物可以在本发明中使用，只要它们是形成IDO的微生物，所述IDO催化从L-异亮氨酸和a-酮戊二酸合成(2S,3R,4S)-4HIL的反应，并且优选的微生物包括苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2和苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型；ATCC35646)菌林。在这些之中，苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2是尤其优选的。和固体培养，但是在工业上有利的方法是深通气搅拌培养(deep-aeratedstircultivation)。通常用于微生物培养的碳源、氮源、无机盐和其它痕量营养元素可以用作营养培养基的营养元素。可以使用所有营养来源，只要它们能够为使用的微生物菌抹所利用。通过振荡培养、深换气搅拌培养(deepventilationstirculturing)等使培养在需氧条件下进行。培养温度在可以满足微生物生长并产生IDO的范围内。因此，尽管条件并不严格，但是培养温度通常是10-50°C,并且优选15-42。C。培养时间根据其它培养条件而改变。例如，可以将微生物培养至产生最大量的IDO，而这通常是大约5小时至7天，并且优选大约10小时-96小时。在培养之后，通过离心(例如，10,000xgIO分钟)回收微生物细胞。由于大部分IDO存在于细胞中，通过破裂或溶解微生物细胞来使IDO溶解。超声破裂、弗氏压碎破裂或玻璃珠破裂可以用来使微生物细胞破裂。在溶解细胞的情况下，采取使用卵白溶菌酶(eggwhitelysozyme)的方法、肽酶处理或它们的合适组合。当纯化源自产IDO微生物的IDO时，尽管是通过使用酶溶解溶液作为起始材料来纯化IDO，但是如果残存未破裂或未溶解的残余物，那么重新离心溶解溶液并去除沉淀的任何残余物对于纯化是有利的。所有通常使用的用于纯化普通酶的方法可以用于纯化IDO,其实例包括硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水相互作用层析和羟磷灰石层析。结杲，可以获得具有较高比活性的含IDO级分。(ii)使用重组DNA技术的产生方法接下来，提供关于使用重组DNA技术产生IDO的方法的说明。存在许多使用重组DNA技术产生有用蛋白诸如酶和生理学活性物质的已知实例，并且重组DNA技术的使用使得大量产生仅以痕量存在于自然界的有用蛋白成为可能。图ll是用于产生本发明IDO的方法的流程图。首先，制备编码本发明的IDO的DNA(步骤Sl)。其次，将制备的DNA与载体DNA连接以产生重组DNA(步骤S2)，并且通过所述重组DNA来转化细胞以产生转化体(步骤S3)。接着将所述转化体在培养基中培养，并且允许IDO形成并在培养基和/或细胞中积累(步骤S4)。其后，所述方法进行至步骤S5，其中通过回收和纯化所述酶来产生纯化的IDO。通过在羟化反应中使用在步骤S5产生的纯化IDO或任何在步骤S4积累了IDO的培养基和/或细胞可以大量产生期望的(2S，3R，4S)-4HIL(步骤S6)。与载体DNA连接的DNA可以允许本发明IDO的表达。在此，连接入载体DNA的IDO基因的实例包括如前文在[I]中所述的DNA。在使用重组DNA技术大规模产生蛋白质的情况下，细胞诸如细菌细胞、放线菌属G4"/w^yc")细胞、酵母细胞、霉菌细胞、植物细胞和动物细胞可以用作进行转化的宿主细胞。已经开发了宿主载体系统的细菌细胞的实例包括埃希氏菌属菌种、假单胞菌属菌种、棒杆菌属菌种、节杆菌属菌种、曲霉属菌种和芽孢杆菌属菌种，并且优选使用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。这是因为有许多关于使用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或芽孢杆菌属细菌大量产生蛋白质的技术的相关知识。下文提供关于使用经转化的大肠杆菌产生L-异亮氨酸双加氧酶的方法的说明。用于大肠杆菌的以下方法也可用于谷氨酸棒杆菌或芽孢杆菌属细菌。通常用于大肠杆菌中异源蛋白产生的启动子可以作表达编码IDO的DNA的启动子，其实例包括强(powerfiil)启动子如T7启动子、tip启动子、lac启动子、tac启动子和PL启动子。为了以融合蛋白包含体的形式产生IDO，在融合蛋白基因中将编码另一种蛋白(优选亲水性肽)的基因连接至IDO基因的上游或下游。所述编码另一种蛋白的基因可以是这样的基因，其增加积累的融合蛋白的量并且增强融合蛋白在变性和再生步骤之后的可溶性，所述基因的候选实例包括T7基因10、p-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因(dehydrofolatereductase),干扰素y基因、白细胞介素-2基因和凝乳酶原基因。当将这些基因与编码IDO的基因连接时，使密码子阅读框匹配。可在合适的限制酶位点连接所述基因或者使用适当序列的合成DNA连接。为了增加产量，优选以融合蛋白基因下游终止子的形式偶联转录终止序列。这种终止子的实例包括T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因终止子和大肠杆菌^x4基因终止子。对于用于将编码IDO或IDO与另一种蛋白质的融合蛋白的基因导入大肠杆菌的载体，优选多拷贝载体，其实例包括具有源自ColEl的复制起点的质粒诸如pUC质粒、pBR322质粒或它们的衍生物。"衍生物"在此指通过碱基取代、缺失、插入、添加或倒位而经过变化的质粒。此处所指的变化包括由使用诱变剂或UV照射的突变处理引起的变化或由自发突变或随机突变引起的变化。为了选择转化体，优选所述载体具有标记如氨千青霉素抗性基因。这些质粒的实例包括具有强启动子的商业上可以获得的表达载体(例如pUC(Takara)、pPROK(Clontech)和pKK233-2(Clontech))。重组DNA可以由连接DNA片段获得，其中将启动子、编码IDO或由IDO和另一种蛋白质组成的融合蛋白的基因、和终止子按照这种顺序与载体DNA连接。当使用重组DNA转化大肠杆菌然后培养该大肠杆菌时，表达并产生IDO或IDO与另一种蛋白质的融合蛋白。通常用于表达异源基因的菌林可以用于所述经转化的宿主，并且大肠杆菌菌林JM109(DE3)和大肠杆菌菌抹JM109是尤其优选的。转化方法和用于选4奪转化体的方法在例如MolecularCloning,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)中描述。在作为融合蛋白表达的情况下，可以使用识别不存在于IDO中的序列作为识别序列的限制性蛋白酶如凝血因子Xa或激肽释放酶来将IDO切下。通常用于培养大肠杆菌的培养基可以用作生产培养基(productionmedium),其实例包括M9酪蛋白氨基酸培养基和LB培养基。此外，培养和产生诱导的条件可以根据载体使用的标记物和启动子的类型，以及使用的宿主微生物的类型来适当地选择。以下方法可以用于回收IDO或IDO与另一种蛋白质的融合蛋白。如果IDO或其融合蛋白溶解在微生物细胞中，那么在回收所述微生物细胞并且破裂或溶解回收的细胞之后，可以将IDO或其融合蛋白以粗制酶溶液的形式使用。另外，IDO或其融合蛋白也可以在通过沉淀、过滤、柱层析或必要的其它常规技术纯化之后使用。在这种情况下，使用IDO或其融合蛋白的抗体的纯化方法也可以使用。当形成蛋白包含体时，用变性剂使其溶解。尽管可以将其与微生物细胞蛋白一起溶解，但是考虑到后续的纯化流程，优选将包含体取出然后再将其溶解。现有技术中已知的方法可以用来从;敞生物细胞回收包含体。例如，可以通过使微生物细胞破裂继而离心分离来回收包含体。溶解蛋白包含体的变性剂的实例包括盐酸胍(例如，6M,pH5-8)和尿素(例如，8M)。通过用处理(如透析)去除这些变性剂，可将蛋白包含体作为活性蛋白再生。透析溶液例如Tris-HCl緩冲液或磷酸盐緩冲液可以用于透析，并且浓度可以是20mM-0.5M，pH可以是pH5-pH8。再生步骤过程中的蛋白质浓度优选保持在约500|ig/ml或更低。为了防止再生的IDO进行自交联，透析温度优选是5。C或更低。另外，预期也可以通当IDO基因源自属于芽孢杆菌属的细菌时，可以通过使用埃希氏菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、曲霉属或芽孢杆菌属的细菌作为宿主以一种优选的模式来表达和产生IDO。基因的拷贝数可以通过将基因插入多拷贝载体，然后将所述载体导入微生物来增加。能够使用的载体包括大肠杆菌质粒载体如pMW118、pBR322、pUC19、pBl薦riptKS+、pACYC177、pACYC184、pAYC32、pMW119、pET22b，大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体如pHY300PLK、pGK12、pLF14、pLF22等，噬菌体载体如11059、旧FIOI、M13mp9、Mu噬菌体(日本专利申请公开No.2-109985)等，和转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.,Bio/Techno1.,1,417(1983))如Mu、TnlO、Tn5等。还可能的是通过利用质粒的同源重组将基因整合入染色体等来增加基因的拷贝数。在这种情况下的宿主细胞和表达系统的实例包括ShawP.C.等对节杆菌属菌种中重组表达方法的报导(JGenMicobiol.134(1988)p.903-911)，SanduC.等对噬烟碱节杆菌04w/zraZ)acferm'co""ovoram)中重组表达方法的报导(ApplEnvironMicrobiol.71(2005)p8920-S924)和Morikawa，M.等对节杆菌属菌种中重組表达方法的报导(ApplMicrobiolBiotechnol.,42(1994),p.300-303)。同样，有数个报导称开发用于棒状杆菌型细菌(Coryneformbacteria)的表达系统也可用于节杆菌属菌种(SanduC.等)。然而，用作宿主细胞的芽孢杆菌属菌种细菌和可用于芽孢杆菌属IDO的表达系统不限于本文所述的那些。用于产生ps,311,48)4-羟基-L-异亮氨酸的方法用于产生本发明的通式(I)代表的(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸((2S，3R，4S)-4HIL)的方法包括直接酶促羟化L-异亮氨酸以产生(2S，3R,4S)-4HIL的一步反应，其由以下反应代表L-异亮氨酸+a-酮戊二酸+02+4HIL+琥珀酸+C02其中所述反应在如下存在下进行作为一个氧原子的受体分子的L-异亮氨酸、作为另一个氧原子的受体分子的a-酮戊二酸、作为两个氧原子的供体的一个氧分子和催化所述反应的IDO。在本发明中，"酶促羟化"的意思是通过IDO酶进行的羟化反应。尤其细菌IDO是优选的。对催化所述反应的IDO没有具体限制，并且可以使用任何蛋白质，只要该蛋白质能够催化在a-酮戊二酸和氧存在下羟化L-异亮氨酸的反应。这种IDO的优选实例是描述IDO的部分[l]中说明的IDO。在本发明的方法中，IDO可以以任何形式使用，所述任何形式如细菌(包括培养物、细菌细胞或经处理的细胞)、纯化的酶或粗制酶，只要其包含(incorporate)催化产生上述(2S，3R，4S)-4HIL的反应的上述IDO。当使用细菌作为IDO来源时，(l)天然产生IDO的细菌，如属于芽孢杆菌属的微生物，和(2)如部分[1]中所述的由重组DNA转化的重组微生物，这二者均可用于通过培养这些微生物来积累IDO。用于表征IDO的蛋白质序列归类为L-异亮氨酸双加氧酶(SEQIDNO:2，SEQIDNO:8表1)。本发明的L-异亮氨酸双加氧酶还包括通过以下特征限定的蛋白质(A)具有催化从L-异亮氨酸和a-酮戊二酸产生(2S,3R,4S)-4HIL的反应的活性；(B)所述活性依赖于二价阳离子包括Fe2、并且(C)如通过SDS-PAGE测量，每个亚基的分子量是约29±2.0kDa。例如，在使用产IDO细菌或已经由重组DNA转化的细菌细胞产生(2S，3R,4S)-4HIL的步骤中，可以在培养时将底物直接添加至培养基，或者可以以细菌细胞或已经与培养物分离的经洗涤细菌细胞的形式使用。此外，已经破裂或溶解的经处理细菌细胞可以直接使用，或者可以从经处理的细菌细胞回收IDO并且用作粗制酶溶液，或者在将酶纯化之后使用。即，只要是具有IDO的级分的形式，即可用在本发明的产生(2S，3R，4S)-4HIL的方法中。为了使用IDO进行羟化反应，将包含L-异亮氨酸、a-酮戊二酸和催化所述反应的蛋白质或含IDO组合物的反应溶液调节至20-50。C的合适温度并且允许其静置(standundisturbed),振荡或搅拌30分钟至5天，同时保持pH5-12。也可以通过向所述反应混合物添加二价阳离子如Fe"来改进反应速度。当向反应溶液添加这些二价阳离子时，尽管可以使用任何盐，只要其不阻碍反应，然而FeS04等可以优选使用。这些二价阳离子的浓度可以通过由本领域普通技术人员进行的简单初步研究来确定。这些二价阳离子添加的范围可以在0.01mM-50mM,优选0.1mM-25mM的范围内。氧通过搅拌从空气进入反应，在培养过程中培养物体积为固定状态(withfixedregimeofculturevolumeduringcultivation)。在所述反应混合物中形成的通式(I)的(2S，3R，4S)-4HIL可以根据已知技术分离或纯化，或者照现状(asitis)进一步使用，特别是当所述反应用表达IDO的重组孩i生物进行时。分离和纯化方法的实例可以包括这样的方法，其中将(2S，3R，4S)-4HIL与离子交换树脂接触来吸附碱性氨基酸，其后进行洗脱和结晶；和这样的方法，其中将通过洗脱获得的产物用活性炭脱色并过滤，其后结晶以获得(2S，3R,4S)-4HIL。来自其它微生物的编码IDO的未注释基因(non-annotatedgene)可以通过与已知IDO基因的同源性，其后评估由这些基因编码的蛋白质的活性来鉴定。两个氨基酸序列之间的同源性可以使用已知的方法确定，例如，计算机程序BLAST2.0，其计算三个参数得分(score)、.同一性(identity)和相似性(similarity)。因此，利用基于氨基酸和核苷酸序列的已知片段制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应，参见White,T丄等，TrendsGenet,5，185(1989))能够获得编码全长IDO的来自苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2和苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型；ATCC35646)菌林的DNA片段。来自其它微生物的编码IDO的DNA片段能够以类似的方式获得。由于细菌菌林之间的DNA序列中可能存在某些差异，使用的上述编码IDO的片段不限于SEQIDNO:1、7、12、16、20、图18或表1中所示的核苷酸序列，而且还可包括与SEQIDNO:1、7、12、16、20、图18或表1中所示的那些相似的核苦酸序列。因此，由上述基因编码的蛋白质变体可以相对于SEQIDNO:2、8、13、17、21、图19或表1中所示的完整氨基酸序列具有不少于80。/。，优选不少于90%,并且最优选不少于95%的相似性，只要该蛋白质催化所述反应的能力得到保留。另外，上述DNA片段可以表示为这样的变体，其能够在严紧条件下与SEQIDNO:l、7、12、16、20、图18或表1中所示核苦酸序列、或与基于这些核苷酸序列制备的探针杂交，条件是它们编码功能性蛋白质。"严紧条件"用于此处与前述部分"[l](l)编码IDO的DNA，，相同。本发明中采用的经处理细菌细胞形式的实例包括干燥的细菌物质(driedbacterialmass)、冻干的细菌物质、用表面活性剂或有机溶剂处理的产物、酶处理产物、超声处理产物、机械研磨产物、溶剂处理产物、细菌物质的蛋白质级分、细菌物质的固定化产物和经加工的细菌物质。IDO可以如上所述分开制备并添加至反应溶液中。表达编码IDO的DNA的细菌(宿主细胞)可以通过以能够在具有那些活性的宿主细胞中表达的形式转染功能性含有所述编码IDO的DNA的表达载体来制备。另外，优选使用通过增加编码IDO的基因的表达而具有增强的IDO活性的宿主细胞。短语"增加基因的表达"的意思是所述基因的表达高于未经修饰的菌抹，例如，野生型菌抹。这种修饰的实例包括增加每个细胞表达的基因的拷贝数，增加基因的表达水平等。例如，通过限制(restrict)染色体DNA，然后使用基于所述基因序列的探针进行Southern印迹，荧光原位杂交(FISH)等来测量表达基因的拷贝数的量。基因表达的水平可以通过多种已知的方法来测量，包括Northern印迹、定量RT-PCR等。由所述基因编码的蛋白质的量可以通过已知方法测量，包括SDS-PAGE后进行免疫印迹测定法(Westem印迹分析)等。"用编码蛋白质的DNA转化细菌"的意思是将所述DNA导入细菌，例如，通过常规方法导入。转化这种DNA将导致编码本发明蛋白质的基因的表达增加，并且将增强细菌细胞中所述蛋白质的活性。转化方法包括迄今已经报导的任何已知方法。例如，用氯化4丐处理受体细胞从而增加细胞对DNA的透过性的方法，所述方法已经报导用于大肠杆菌K-12(Mandel,M.和Higa，A.,J.Mol.Biol.,53，159(1970)),并且可以使用该方法。增强基因表达的方法包括增加基因拷贝数。将基因导入能够在本发明的细菌中发挥功能的载体使所述基因的拷贝数增加。为此，可以优选使用多拷贝载体。多拷贝载体的示例为pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等。基因表达的增强也可以通过将所述基因的多个拷贝通过例如同源重组、Mu整合等导入细菌染色体来实现。例如，一次Mu整合允许向细菌染色体中导入多至3个拷贝的所述基因。基因拷贝数的增加也可以通过将所述基因的多个拷贝导入细菌染色体DNA中来实现。为了将基因的多个拷贝导入细菌染色体中，使用以多个拷贝存在于所述染色体DNA中的序列作为靶进行同源重组。在染色体DNA中具有多个拷贝的序列包括，但不限于重复DNA或转座元件末端存在的反向重复序列。同样，如美国专利No.5,595,889中公开的，可以将基因并入转座子，并且允许所述转座子转移以将所述基因的多个拷贝导入染色体DNA。增强基因表达也可以通过将本发明的DNA置于强启动子的调控下来实现。例如，Ptac启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、人嗟菌体的PR或Pt启动子已知为强启动子。强启动子的使用可以与基因拷贝的增加结合。或者，可以增强启动子的效果，通过例如向所述启动子导入突变以增加位于该启动子下游的基因的转录水平。另外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中取代几个核香酸，特别是在起始密码子的紧邻上游的序列中取代几个核芬酸，显著影响mRNA的翻译能力。例如，依赖于起始密码子之前三个核苷酸的性质，发现了20倍的表达水平变化范围(Gold等，Annu,Rev.Microbiol.，35,365-403，1981;Hui等，EMBOJ"3，623-629,1984)。先前，证明了rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置的A对G的取代(ABSTRACTSof17thInternationalCongressofBiochemistryandMolecularBiologyinconjugationwith1997AnnualMeetingCaliforniaAugust24-29，1997，abstractNo.457)。另外，也可以将核苷酸取代导入细菌染色体上所述基因的启动子区中，其导致更强的启动子功能。例如，表达调控序列的改变可以按照与使用温度敏感质粒的基因取代相同的方式进行，如国际/>开WO00/18935和日本专利申请公开No.1-215280中7>开。用于制备质粒DNA的方法包括，但不限于消化和连接DNA、转化、选择作为引物的寡核苷酸等，或本领域技术人员熟知的其它方法。这些方法在例^口"MolecularCloningALaboratoryManual,ThirdEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)中描述。实施例将参考下文所示实施例对本发明进行更详细地说明，然而本发明不限于此。实施例丄筛选具有L-异亮氨酸羟化酶的菌株<1〉筛选产4-鞋基异亮氨酸的菌抹和培养液分析通过使用L-异亮氨酸作为底物，对具有产生4-羟基异亮氨酸的能力的微生物进行筛选。在水中，溶解0.4。/。(w/v)的可溶性淀粉、0.4%的酵母提取物、1%的麦芽提取物(maltextract)和0.2%的L-异亮氨酸，然后将溶液调节至pH7-7.5以获得培养基，并且将土壤细菌接种至所述培养基中。在28。C振荡培养2天之后，通过对离心上清液的氨基酸分析来分析4-羟基异亮氨酸。氨基酸分析条件通过使用WatersAccQ-Tag方法来检测4-鞋基异亮氨酸。将稀释至适当浓度的5iil反应混合物中的氨基酸以常规方式衍生化，并且通过HPLC分析来测量4-羟基异亮氨酸的产量。结果，发现一种细菌菌林(菌林2-e-2)具有产生与4-羟基异亮氨酸显示相同保留时间的物质的活性。基于16SrDNA分析，将菌抹2-e-2鉴定为苏云金芽孢杆菌。因此，对其它芽孢杆菌属细菌也进行了筛选，并且在地衣芽孢杆菌(菌抹AKU223、菌抹IAM11054)，球形芽孢杆菌(菌林AKU227、菌林NBRC3526)和苏云金芽孢杆菌(菌抹AKU238、菌抹NBRC3958)中也发现了类似的活性。鉴定产物对由上述筛选中获得的芽孢杆菌属菌林从作为底物的L-异亮氨酸产生的物质进行了鉴定。首先，通过MS分析了所述产物的分子量，发现分子量是145，比4-羟基异亮氨酸的分子量小2。另外，当使用高分辨率质谱仪(Q-TofMS)通过精确质量测量估计組成化学式(compositionformula),获得了C6HuN03并且发现具有的氢原子在数目上比4-羟基异亮氨酸少2个。以上结果说明由上述芽孢杆菌属菌抹产生的物质可能是2-氨基-3-酮-4-曱基戊酸(AMKP)。根据有关芽孢杆菌属细菌产生AMKP的报告中描述的实验方法(BioorganicChemistry，Vol.6，pp,263-271，1977),合成并纯化了AMKP。进而根据BioorganicChemistry,Vol.6,pp.263-271，1977的AMKP纯化方法从上述芽孢杆菌属细菌的培养基纯化了产物，并且进行了NMR分析。结果，二者均显示了类似的化学位移。以上内容揭示了在此实验中发现的芽孢杆菌属细菌产生AMKP。由菌抹2-e-2产生的AMKP的量是大约1-2mM。另一方面，由BioorganicChemistry,Vol.6,pp.263-271，1977中所述芽孢杆菌属细菌产生的AMKP的估计量是0.04mM，因此确认了菌株2-e-2的高AMKP产生活性。<2〉建立用于分离和分析AMKP和HIL的方法由于发现了芽孢杆菌属细菌(如菌抹2-e-2)具有AMKP产生活性，因此发现有必要建立用于分离和分析AMKP和4-羟基异亮氨酸的方法。多种考察之后，通过修改WatersAccQ-TagTM方法建立了用于分离和分析AMKP和4-羟基异亮氨酸的方法。具体而言，将柱变为XBridgeC185mm,2.1x150mm(Waters),将EluentB(洗脱剂B)变为MeOH,并且将洗脱剂流速变为0.3ml/min。洗脱剂的梯度示于下表。表2:同时分析HIL和AMKP的洗脱剂条件<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>在上述条件下，培养基中的AMKP在大约11.0分钟洗脱，4-羟基异亮氨酸在大约11.9分钟洗脱，因此能够将这些产物分离。<3>通过在培养过程中添加辅因子改变AMKP产量作为AMKP产生活性的机制，考虑了通过羟化摄取分子氧的可能性。因此，通过在菌抹2-e-2的培养过程中添加单加氧酶的辅因子NAD(P)H,或添加双加氧酶的辅因子Fe2+、2-酮戊二酸和抗坏血酸来分析AMKP产生活性。通过使用先前筛选中使用的培养基作为对照，比较了10mMNADP和10mMNADPH添加组，Fe"添加组，以及Fe"、2-酮戊二酸和抗坏血酸添加组的AMKP产生活性。培养温度是30。C，培养实践是22小时。测量了培养物上清中的AMKP浓度。结果示于表3。表3:菌抹2-e-2的培养中辅因子的添加对AMKP产生活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>这说明双加氧酶可能参与了AMKP的产生过程。<4>菌抹2-e-2培养液随时间的变化将AMKP产生培养基(0.4。/o(w/v)的可溶性淀粉、0.4%的酵母提取物、1%的麦芽提取物、0.2。/。的L-异亮氨酸、0.5%的葡萄糖、lmM抗坏血酸、lmM2-酮戊二酸、1mMCaCl"lmMMgS04,pH7-7,5)置于3升Sakaguchi烧瓶中，并且在23。C振荡培养菌抹2-e-2。在培养开始后的0、6、8、10、12、14、16、18和20小时，取样培养液(culturebroth),并且通过上文描述的<2〉中所述方法定量培养液中的4-羟基异亮氨酸和AMKP。另外，还测量了浊度(00660)。4-羟基异亮氨酸(HIL)和AMKP的浓度示于图1。培养液的浊度示于图2。4-羟基异亮氨酸和AMKP的总量在对数生长期增高并且随后达到平台。进一步地，在水平达到平台之后，4-羟基异亮氨酸逐渐减少，而AMKP逐渐增力口。在每个上述培养时间，从200pl的所述培养液获得菌株2-e-2的细胞，用生理盐水洗涤，然后悬浮在100iil双加氧酶反应混合物(lOmM异亮氨酸、1mMFe2+、10mM2-酮戊二酸、10mM抗坏血酸、50mM磷酸钾緩冲液(pH7.0))中，使反应在30°C在振荡条件下进行1小时，并且测量上清液中4-羟基异亮氨酸和AMKP的产量。结果，仅当使用在对数生长期的细胞时，能够确认4-羟基异亮氨酸和AMKP的产生，尽管它们以痕量产生，如图3所示。<5>用菌抹2-e-2细胞裂解物产生HIL将细胞在AMKP产生培养基中培养直至达到00660为3,2,在研钵中使收集并经洗涤的菌抹2-e-2细胞破裂，然后悬浮在悬浮用緩冲液(50mMHEPES(pH7.0)、10%甘油、CompleteMini(Roche))中以获得具有约10mg/ml蛋白质浓度的悬液(裂解物)，并且获得了所述悬液的离心沉淀物。最终将所述离心沉淀物悬浮在与所述细胞裂解物等体积的生理盐水中。将这些中的每个与等体积的2x双加氧酶反应混合物(IOmM异亮氨酸、2mMFe2+、10mM2-酮戊二酸、10mM抗坏血酸、100mMHEPES(pH7.0))混合，并且使反应在30。C进行1小时。类似地，洗涤用于制备所述细胞裂解物的静息细胞，并且以IO倍于培养液中的浓度悬浮在生理盐水中，将所述悬液与等体积的2x双加氧酶反应混合物混合，并且使其进行反应。样品中AMKP和4-羟基异亮氨酸的产量示于图4。通过使用细胞裂解物，能够毫无疑义地确认使用11e作为底物产生4-羟基异亮氨酸的活性。<6〉辅因子对菌抹2-e-2细胞裂解物中的酶的作用通过使用在对数生长期的菌抹2-e-2细胞的细胞裂解物，检验了辅因子对通过羟化lie产生4-羟基异亮氨酸的反应的作用。使所述反应在50mMHEPES(pH7)反应混合物中进行，在所述反应混合物中含有终浓度为5mMlie和5mM多种辅因子之一，以及通过上述<5>中描述的方法制备的对数生长期菌抹2-e-2细胞(裂解物)的细胞裂解物，并且测量了4-羟基异亮氨酸的产量。如表4中所示，Fe2+(Fe)和2-酮戊二酸(a-KG)对于4-羟基异亮氨酸的产生是关键的，而通过进一步添加抗坏血酸(Asc.)使4-羟基异亮氨酸的产量最大化。因此，有力地说明了双加氧酶可能涉及通过羟化异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸。表4:多种辅因子对菌抹2-e-2细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生活性的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><7>使用菌抹2-e-2细胞裂解物获得的产物的空间构型4-羟基异亮氨酸在3个位置具有不对称碳原子，并且存在8种类型的非对映异构体和4对对映异构体。具体而言，所述4对对映异构体是(2S,3S,4S)和(2R，3R,4R)对映异构体(在后也称为HIL1),(2S,3S,4R)和(2R,3R,4S)对映异构体(在后也称为HIL2)，PS，SR，4R)和PR^S，化)对映异构体(在后也称为HIL3),以及(2S,3R,4S)和(2R，3S，4R)对映异构体(在后也称为HIL4)。胡卢巴中存在的天然存在的HIL等是(2S，3R,4S)对映异构体。由于在本发明中将(2S,3S)-异亮氨酸用作底物，通过羟化反应产生的4-羟基异亮氨酸是(2S,3R，4S)或(2S,3R，4R)对映异构体。因此，决定要确定由菌抹2-e-2产生的4-羟基异亮氨酸的空间构型。作为不同的对映异构体对，(2R，3R,4R):HIL1和(2S，3R，4R):HIL3才艮据Tetrahedron47(32)，6469-6482,(1991)获得，而(2R，3R，4S):HIL2和(2S,3R,4S):HIL4根据Eur.J.Org.Chem.834-839,(2002)获得。当在上述<2〉中所述同时分析4-羟基异亮氨酸和ANKP的条件下分析由化学合成获得的HIL1至HIL4时，保留时间如表5中所示。表5:4-羟基异亮氨酸的非对映异构体的保留时间<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>当分析上述<6>中制备的含4-羟基异亮氨酸的样品时，保留时间是11.99分钟。当将它与HIL4标准品的4-羟基异亮氨酸混合并分析时，峰完全匹配。因此，证明了当使用(2S,3S)-异亮氨酸作为底物时，在可能产生的HIL3和HIL4中，由这种酶产生的4-羟基异亮氨酸是HIL4，即，天然存在的4-羟基异亮氨酸。<8>菌抹2-e-2细胞裂解物中的酶的最适pH通过使用根据上述<5>中描述的方法从0066()为7的菌株2-e-2细胞制备的细胞裂解物，评估了4-羟基异亮氨酸产生活性的pH依赖性。测量了由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMGTA组成的双加氧酶反应混合物在反应之后的组成，和所述反应混合物的pH。反应温度为30°C。通过<2>中所述方法分析了产生的4-羟基异亮氨酸。在多个pH值的活性按照相对活性比例示于图5，所述比例基于在提供最大产量的pH产生的HIL量(取作100%)计算。在pH5-8确认了所述活性。<9>菌林2《-2细胞裂解物中的酶的最适温度通过使用根据上述<5〉中描述的方法从0066()为7的菌抹2-e-2细胞制备的细胞裂解物，评估了4-羟基异亮氨酸产生活性的温度依赖性。双加氧酶反应混合物的组成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMGTA(pH6)组成，并且反应温度为15-50°C。通过<2〉中所述方法分析了产生的4-羟基异亮氨酸。在多个温度的活性按照相对活性比例示于图6,所述比例基于在提供最大产量的温度产生的4-羟基异亮氨酸量(取作100%)计算。最适温度低于45。C。<10>菌抹2《-2细胞裂解物中的酶的温度稳定性通过使用根据上述〈5〉中描述的方法从OD66o为7的菌抹2-e-2细胞制备的细胞裂解物，评估了4-羟基异亮氨酸产生活性的温度稳定性。将细胞裂解物在0-50。C温育1小时，然后测量Ile羟化活性。底物反应混合物的组成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMHEPES(pH7)组成，并且反应温度为30°C。通过实施例2中所述方法分析了产生的4-羟基异亮氨酸。在多个温度的温度稳定性按照相对活性比例示于图7，所述比例基于在提供最大产量的温度产生的4-羟基异亮氨酸量(取作100%)计算。所述酶在50。C或更高温度失活。<11>菌林2-e-2细胞裂解物中酶的底物反应特性通过使用根据上述<5>中描述的方法从0066()为7的菌抹2-e-2细胞制备的细胞裂解物，评估了多种氨基酸的反应特性。将细胞裂解物和底物溶液混合，然后使反应在30。C进行1小时，并且通过TLC或氨基酸分析来评估新物质的产生。底物反应混合物的组成由5mM氨基酸、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMHEPES(pH7)组成。除了L-异亮氨酸，作为氨基酸还独立评估了L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸。通过实施例1中所述方法分析了产生的4-羟基异亮氨酸。结果示于表6。对于除L-异亮氨酸以外的氨基酸无法确认新物质的产生。因此，说明了这种酶是异亮氨酸特异性双加氧酶。表6:对于多种氨基酸的反应性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><12〉抑制剂对菌抹2-e-2细胞裂解物中的酶的作用通过使用根据上述0中描述的方法从OD660为7的菌林2-e-2细胞制备的细胞裂解物，检验了抑制剂对4-羟基异亮氨酸产生活性的作用。使用了根据上述〈5〉中描述的方法从OD66o为7的菌抹2-e-2细胞制备的细胞裂解物。双加氧酶反应混合物的组成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMHEPES(pH6)组成，反应温度为30。C，并且反应时间为l小时。测量了当向反应体系添加10mM的每种抑制剂(EDTA、Cu2+、Zn2+)时产生的4-羟基异亮氨酸量。通过上述<2>中所述方法分析了4-羟基异亮氨酸。异亮氨酸羟化活性因所述抑制剂而丧失。实施例2.L-Ile羟化酶的分离和纯化(l)无细胞提取物的制备将菌抹2-e-2培养在总体积2升的AMKP生产培养基中直至0066()达到6.0，然后将细胞用生理盐水洗涤。将所述细胞悬浮在细胞膜处理溶液(10mg/ml裂解酶(SIGMA)、5mg/ml纤维素酶"ONOZUKA"R-10(Yakult)、Yatalase(TakaraBio)、1mg/ml溶菌酶(SIGMA)，溶于0.2MNaH2P04和0.6MKC1(pH5.5))中，然后在30。C温育1小时。将经温育的细胞用生理盐水洗涤，然后悬浮在緩冲液A(50mMHEPES(pH7.0)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、Complete(Roche))中，并且在以冰冷却的条件下通过使用超声破碎仪(Branson)使所述细胞破裂。将这种经处理的悬液在4。C和18,500xg离心60分钟以获得上清。后续的分离和纯化步骤全部在4。C或用冰冷却的条件下进行。(2)阴离子交换层析将前述步骤中获得的上清通过孔径0.45pm的滤器过滤，并且施加于预先用缓沖液A平衡的DEAE柱(16mmx100mm,GEHealthcareBio-Sciences)。用緩冲液A洗涤该柱，并且用溶于緩沖液B(50mMHEPES(pH7.0)、10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、0.5MNaCl、Complete(Roche))的线性浓度梯度的氯化钠进行洗脱。(3)活性级分的检测将每种级分用于在30。C进行30分钟的使用lie羟化活性反应混合物(终浓度为100mMHEPES(pH6.0)、5mML-Ile、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸)的反应。在100。C使酶失活，然后通过前述AMKP和HIL分离和测量方法来定量4-羟基异亮氨酸的量。在后续分析中提及的4-羟基异亮氨酸意指基本上仅由与天然存在的4-羟基异亮氨酸具有相同保留时间的异构体组成的物质。将每分钟产生1nmolHIL的酶活性定义为1U。(4)阳离子交换层析将前述步骤中获得的活性级分在脱盐柱(GEHealthcareBio-Sciences)中用緩沖液C(50mMMES(pH5.2)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、Complete(Roche))替换。将这种替代的级分施加于预先用緩沖液C平^f軒的MonoS柱(IOmmx100mm,GEHealthcareBio-Sciences)。用緩冲液C洗涤该柱，然后用溶于緩冲液D(50mMMES(pH5.2)，10%甘油，2mMDTT,1mMEDTA,0.5MNaCl,Complete(Roche))的线性浓度梯度的氯化钠进行洗脱，并且测量每种级分的Ile羟化活性。C5)硫酸铵沉淀向前述步骤中获得的可溶性级分添加2M^L酸铵并溶解。充分搅拌所述溶液，然后通过离心分级成可溶性级分和沉淀级分，并且将所述沉淀级分溶解在緩沖液A中。在测量每种级分的Ile羟化活性时，4企测沉淀级分中的所述活性。(6)大小排阻层析将前述步骤中获得的活性级分上样至预先用緩沖液A平衡的Superdex75柱(10mmx300mm,GEHealthcareBio-Sciences)。用緩沖液A进行洗脱，并且测量了每种级分的lie羟化活性。(7)疏水相互作用层析将前述步骤中获得的活性级分用緩冲液E(50mMMES(pH6.5)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、1M硫酸铵、Complete(Roche》替换。将经緩沖液替代的样品施加于预先用緩沖液E平衡的ResourcePHE柱(lml，GEHealthcareBio-Sciences)。用緩冲液E洗涤该柱，然后通过使用反向线性浓度梯度的硫酸铵用缓冲液F洗脱(50mMMES(pH6.5)，10%甘油、2mMDTT、1mMEDTA、Complete(Roche))包含具有lie羟化活性的酶的级分。纯化和分离L-Ile羟化酶的概要总结在表7中。表7:分离和纯化的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>实施例3.L-Ile羟化酶的表征<1>通过电泳分析通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶PAGMini"Daiichi"15/25(13孑L),由DaiichPureChemicalsCo.,Ltd.生产，分子量标准PrestainedSDS-PAGEStandards(预染色的SDS-PAGE标准物)，LowRange,由Bio-Rad产生)分析实施例2中获得的纯化样品。结果发现了所述酶基本上由具有约31,000±20,000分子量的相同(uniform)亚基组成。<2>添加辅因子的作用通过使用纯化酶检验了辅因子对通过羟化lie产生4-羟基异亮氨酸的反应的作用。将通过实施例2中所述方法制备的L-Ile羟化酶用于100mMHEPES(pH6)反应混合物中的所述反应，该反应混合物包含按终浓度计5mML-Ile和5mM多种辅因子之一，并且测量了4-羟基异亮氨酸的产量。如表8所示，Fe"和2-酮戊二酸对于4-羟基异亮氨酸的产生是关键的，并且通过进一步添加抗坏血酸使4-羟基异亮氨酸的产量最大化。因此，有力地说明了双加氧酶可能参与了通过羟化L-异亮氨酸的4-羟基异亮氨酸产生。这种结果与使用细胞裂解物的检验结果相同。表8:多种辅因子对纯化酶的4-羟基异亮氨酸产生活性的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><3>最适pH通过使用根据实施例2中所述方法制备的L-异亮氨酸羟化酶，评估了4-羟基异亮氨酸产生活性的pH依赖性。酶反应溶液的组成由5mML-Ile、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和200mMGTA(pH3至12)组成。反应温度为30。C。在多种pH值的活性按照相对活性比例示于图8,所述比例基于在提供最大产量的pH产生的4-羟基异亮氨酸量(取作100%)计算。在pH4至8确认了活性，并且确认了在pH5至8的高活性。<4>最适温度通过使用根据实施例2中所述方法制备的L-Ile羟化酶，评估了4-羟基异亮氨酸产生活性的最适温度。酶反应溶液的组成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMHEPES(pH6)组成。在多种温度的活性按照相对活性比例示于图9，所述比例基于在提供最大产量的温度产生的4-羟基异亮氨酸量(取作100°/。)计算。在0至40°C的温度范围确认了高活性。<5>温度稳、定性通过使用根据实施例2中所述方法制备的L-Ile羟化酶，评估了4-羟基异亮氨酸产生活性的温度稳定性。将pH7.0的酶溶液在0至70°C温育1小时，然后测量lie羟4b活性。酶反应;容液的组成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMHEPES(pH6)组成，并且反应温度为30。C。在各种温度的温度稳定性按照相对活性比例示于图10，所述比例基于在提供最大产量的储藏温度产生的羟基异亮氨酸量(取作100%)计算。所述酶在60°C或更高温度失活。<6>底物反应特性通过使用根据实施例2中所述方法制备的L-Ile羟化酶，评估了多种氨基酸的反应特性。将酶溶液和所述反应混合物混合，然后使反应在30。C进行l小时，并且通过HPLC分析来评估新物质的产生。酶反应溶液的组成由5mM氨基酸、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMHEPES(pH6)组成。除了L-异亮氨酸，作为氨基酸还独立评估了D-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸。通过实施例1中所述方法分析了产生的4-羟基异亮氨酸。结果示于表9。正如使用细胞裂解物的检验结果，对于除L-异亮氨酸以外的氨基酸无法确认新物质的产生。因此，说明了所述酶是L-异亮氨酸特异性双加氧酶，并且具有产生天然存在的HIL的活性，与使用细胞裂解物的检验结果所示类似。表9:每种氨基酸的反应性<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><7>抑制剂的作用通过使用根据实施例2中所述方法制备的L-Ile羟化酶，检验了抑制剂对4-羟基异亮氨酸产生活性的作用。酶反应溶液的组成由5mMIle、5mMFe2+、5mM2-酮戊二酸、5mM抗坏血酸和100mMHEPES(pH6)组成，反应温度为30°C，并且反应时间为1小时。测量了当向反应体系添加10mM的每种抑制剂(EDTA、Cu2+、Zn,时产生的4-羟基异亮氨酸量。添加抑制剂的条件下观察的4-羟基异亮氨酸产生活性按照相对活性示于表10，所述相对活性是相对于未添加抑制剂的条件下所观察的4-羟基异亮氨酸产生活性(取作100%)而言的。异亮氨酸羟化活性因所述抑制剂而丧失。表10:抑制剂的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><8>忭末端氨基酸对根据实施例2中描述的方法制备的L-Ile羟化酶根据实施例3的方法进行电泳，转移至PVDF膜(sequi-BlotTMPVDF膜，Bio-Rad),并用于PPSQ-10(其为由ShimadzuCorporation生产的蛋白质测序仪)。作为通过上述方法获得的酶的N-末端序列得到了如下结果。ILysMetSerGlyPheSerlleGluGluLys10IIValHisGluPheGluSerLysGlyPheLeu20(SEQIDNO:5)实施例4.从苏云金芽孢杆菌(2-e-2)菌抹纯化IDO对本发明的发明人提供的环境微生物的筛选揭示了具有a-酮戊二酸依赖性L-异亮氨酸双加氧酶活性的独特微生物。将其鉴定为苏云金芽孢杆菌，并作为苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2(FERMBP-10688)保藏(stock)。1.1.培养条件。在实验中使用了以下培养基CM1(胰蛋白胨1Og/l;酵母提取物10g/l;通过NaOH调节的pH7.0);CM6(胰蛋白胨10g/l;酵母提取物40g/l;通过NaOH调节的pH7.0)。1，2.接种物制备。将苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2在补充有90mMKPi緩冲液(90mMKH2P04(pH7)通过KOH调节)的CM1培养基中在30°C培养过夜。然后，向完成生长的生物质添加多至20%的甘油。将获得的细胞悬液分装入1.9ml小瓶并储存在-70。C直至使用。1.3.发酵条件。使用Marubischi发酵器进行苏云金芽孢杆菌菌抹2-e_2发酵。使用了以下培养参数起始培养物体积-600ml;搅拌-800转/分；通气(air)-1:1;使用1HNaOH/HCl补料稳定在pH7.0。使用来自一个小瓶(1.9ml)的冷冻悬液(参见前项)接种600mlCM6培养基。将菌林2-e-2培养约7.5小时。然后通过离心收获细胞并且储藏在-70。C直至^f吏用。1.4.IDO活性测定法。通踪4°C离心从25-100ml苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2培养物收获细胞，并且将细胞重悬在2ml緩冲液A(50mMMOPS、10%甘油、lmMEDTA、lmMDTT、蛋白酶抑制剂，pH7.2)中。使用弗氏细胞压碎器(French-pressurecell)(3X在1000Psi)破碎细胞。反应混合物(50ial)包含50mMHEPESpH7.0;5mMIle;5mM抗坏血酸；10mMFeSO4;5mMa-酮戊二酸和蛋白质制备物的等分试样。将反应在振荡条件下在34°C温育40分钟。使用TLC分析检测合成的4HIL。用显影溶剂(2-丙醇:丙酮氨水二100:100:25:16)显影用反应溶液的等分试样(l-2pl)点样的薄层硅胶板(10x15cm)，并且使用茚三酮试剂检测4HIL。如实施例4中所述进行了HPLC分析。1.5从苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2纯化和鉴定IDO使用AKTAbasiclOO系统(AmershamPharmaciaBiotech)进行所有层析步骤。纯化规程包括以下步骤。将冷冻的细胞(62g重量生物质)解冻并且重悬在150ml緩冲液A[50mMTRIZMA，5%甘油，1mMEDTA，1mMDTT，蛋白酶抑制剂，通过HC1调节的pH7]中。,4fA通过两次经过(2passages)弗氏细胞压碎器(最大P=1000Psi)使细胞破裂，其后离心(14000g，4°C，20分钟)以去除细胞碎片。将获得的蛋白制备物添加至150ml在緩沖液A中平衡的DEAE树脂。将最终的悬液在轻柔振荡条件下在4。C温育约IO分钟。然后，将吸附了蛋白的树脂转移至柱(26X30cm)并进行两步蛋白质洗脱。首先，通过溶于緩冲液A的50mMNaCl洗涤柱子。然后，通过溶于緩冲液A的250mMNaCl洗脱IDO活性。通过硫酸铵沉淀(以1.9M)浓缩IDO活性并且重悬在约3ml缓冲液B[50mMTRIZMA，5%甘油，1mMEDTA,1mMDTT,100mMNaCl,pH7]中。,-翬3.将1.5ml获得自#嚴2的制备物施加于用緩冲液B平衡的Superdex200HR10门0A柱。以0.5ml/min流速进行等度洗脱。汇集活性级分。,嚴？.将获得自,嚴3的蛋白制备物施加于用緩冲液A平衡的1.6mlSoursel5Q柱。以0.5ml/min流速通过溶于緩沖液B的线性梯度0-0.5MNaCl(10柱体积)进行洗脱。收集每个lml级分。汇集活性级分。结果，将IDO纯化约120倍(见表11)。最终蛋白制备物的SDS-PAGE显示了仅一个主条带(总蛋白质的约70%,见图12)。_表ll.从苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2纯化IDO<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>1.6鉴定IDO。从SDS-PAGE提取了主要的蛋白质，并且通过质谱分析进行了分析。凝胶处理、胰蛋白酶水解、蛋白质提取和通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间(MALDI-TOF)的质量分析根据由Govorun，V.M.等，(TheproteomecomparativeanalysisofT/e/z'coZ)ocfer/y/on'clinicalisolates.Biochemistry(Mosc),68,1,42-49(2003))描述的规程进行。使用Mascot软件(MatrixScienceUSA)的PeptideFingerprint(肽指紋)选项通过成组的所述蛋白质的光解肽质量鉴定了该蛋白质。通过MS分析将所分析的蛋白质鉴定为来自苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型；ATCC35646)菌抹的推定的RBTH—06809蛋白(图13)。实施例5.从苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2和苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型，ATCC35646)菌抹克隆IDO基因在SDS(15-25。/。)聚丙烯酰胺凝胶中对纯化的样品进行电泳。在室温以1mAcn^在1小时的过程中将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上。在用CBB染色之后，将IDO条带切下并进行用蛋白质测序4义PPSQ-10型(ShimadzuCo.Ltd.,Kyoto,Japan)进行的自动埃德曼降解(Edmandegradation),测定了所述純化蛋白质的前20个N-末端氨基酸。测定31-kDa多肽的N-末端氨基酸为KMSGFS正EKVHEFESKGFL(SEQIDNO:5)。BLAST搜索之后，这种tt酸序列与来自苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型)ATCC35646的假设蛋白RBTH—06809和来自蜡状芽孢杆菌ATCC14579的BC1061显示了高同源性，如表1中所示。对RBTH—06809ORF的序列分析和对纯化蛋白质的N-末端氨基酸的测定说明仅存在一个潜在的IDO翻译起点，因为典型的SD序列位于ATG起始密码子上游8bp处(图14)。然而，Lys(7)是纯化蛋白的N-末端氨基酸。推断N-末端加工(N-末端氨基酸的切割)是IDO活性所需的。看起来，这种切割是特异性蛋白酶的特征(attribute),所述蛋白酶与芽孢杆菌属菌种中的IDO共表达，但是在大肠杆菌中缺乏该蛋白酶。所以，为了在大肠杆菌中产生成熟的IDO，构建了特殊的重组质粒。2丄细菌苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型，ATCC35646)菌抹获得自俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM),登录号B-197。2,2构建pMW119-IDO(Lys，32)质粒。为了构建pMWl19-IDO(Lys,32)，进行了以下步骤。使用寡核苷酸SVS170(SEQIDNo:3)和SVS169(SEQIDNo:4)作为引物(具体参见图15)和纯化的染色体DNA作为模板扩增了苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型，ATCC35646)菌林染色体的0.8kbDNA片段。使用了以下PCR规程初始循环为94。C30秒；4个循环的94°C40秒，49°C30秒，72。C40秒；35个循环的94。C30秒，54。C30秒，72。C30秒。将获得的PCR片段用Sam7/I和&cl内切核酸酶消化，然后连接至先前用相同的限制酶(restrictase)处理的pMW119载体中。2.3构建pMW119-IDO(Lys，23)质粒。使用寡核苷酸SVS170(SEQIDNo:3)和SVS169(SEQIDNo:4)作为引物(具体参见图15)和纯化的染色体DNA作为模板扩增了苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2染色体的0.8kbDNA片段。使用了以下PCR规程初始循环为94。C30秒；4个循环的94。C40秒，49。C30秒，72。C40秒；35个循环的94。C30秒，54。C30秒，72。C30秒。将获得的PCR片段用和5"acl内切核酸酶消化，然后连接至先前用相同的限制酶处理的pMWl19载体中。用连接混合物转化大肠杆菌菌抹TG1的细胞。在X-gal/IPTG琼脂板上选择所得克隆(蓝/白测试)。然后，检测所选克隆的粗制细胞裂解物中的IDO活性。结果，选择了TG1[pMW119-(Lys,32)]和TG1[pMW119-(Lys，23)]两个克隆。分离了相应的质粒，并且对于每个质粒的克隆&m//l-&cl片段进行了序列分析(参见图16、图17)。分析测定的DNA序列显示了克隆的基因和已知RBTH—06809ORF间的差异(图18、图19)。此外，测定了在质粒pMW119上IDO(Lys，23)调节区中的点突变，导致消除前导肽(l)的TAA终止密码子并且使它的翻译延伸至TGA终止密码子(前导肽(2)),其与ATG起始密码子重叠(参见图15A、C)。在"-2"位置检测到额外的突变，其中A取代了C(参见图15,C)。2.4.TGl[pMW119-IDO(Lys，23)和TGl[pMW119-IDO(Lys，32)菌抹的粗制细胞裂解物中IDO活性的测定。为了研究重组大肠杆菌菌抹的粗制细胞裂解物中的IDO活性，进行了以下步骤。通过在4。C离心从5ml培养物收获了细胞，重悬在0.5ml緩沖液A915(50mMTRIZMA，5%甘油，1mMEDTA，lmMDTT,通过HC1调节的pH7)中并通过在4。C的超声处理使其破裂。反应混合物(50)uil)包含50mMHEPESpH7.0;5mMlie;0.5mMa-酮戊二酸；5mM抗坏血酸；5mMFeS04和蛋白制备物的等分试样。将反应在振荡条件下在34°C温育1小时。使用TLC或HPLC分析如实施例4中所述牙全测合成的4HIL。结果总结在表12中。表12.<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>实施例6.使用IDO活性将L-异亮氨酸生物转化为4HIL在补充了氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中培养重组大肠杆菌菌株TGl[pMW119-IDO(Lys,23)]和TGl[pMW119-IDO(Lys,32)]的细胞，直至达到光密度A54Q=4-5(约6小时)。其后通过离心从2ml培养液收获细胞，重悬于lml溶液MI50(100mMKH2P04(通过NaOH调节pH7)，NH4C120mM，MgS042mM,CaCl20.1mM，氨千青霉素150pg/ml,lie50mM,0，5mMa-酮戊二酸，甘油1%，酵母提取物-0.005g/l)。然后，将细胞培养约12小时。其后，通过TLC(HPLC)分析检查4HIL的浓度。将获得的数据总结在表13中。从表12中可以看出，与TGl[pMW119-IDO(Lys，32)]相比，TGl[pMW119-IDO(Lys，23)]引起了较大量4HIL的积累。表13.<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>实施例7.用HPLC测量积累的4-羟基-L-异亮氨酸HPLC分析使用了带有荧光分光光度计1100系列(Agilent,USA)的高压层析仪(Waters,USA)。所选4企测波范围激发波长250nm,发射波长范围320-560nm。在柱Nova-PakTMC18150x3.9誰，4pm(Waters,USA)在+400。C进行通过accq-tag(accq-标记)法的分离。样品的注入体积为5|li1。氨基酸书亍生物的形成和它们的分离根据Waters制造商的建议(Liu，H.等，J.Chromatogr.A,828,383-395(1998);Watersaccq-tagchemistrypackage.Instructionmanual.MilliporeCorporation,pp.1-9(1993))进行。为了获得具有6-氨基喹啉-N-羟基琥玉白醜亚胺基曱酸酉旨(6-aminoquinolil-N-hydroxysuccinymidylcarbamate)的氛基酸衍生物，使用了试剂盒Accq-FluorTM(Waters,USA)。使用浓缩的Accq-tagEluentA(Waters,USA)进行了通过accq标记法的分析。全部溶液4吏用Milli-Q水制备，将标准溶液储藏在+4°C。实施例8.从蜡状芽孢杆菌ATCC14597、苏云金芽孢杆菌AKU238和韦氏芽孢杆菌KBAB4克隆Wo基因(l)制备染色体DNA将蜡状芽孢杆菌ATCC14579、苏云金芽孢杆菌AKU238和韦氏芽孢杆菌KBAB4各自在5mlLB培养基中在28°C培养过夜(预培养)。使用1.5ml培养液作为种子，在50mlLB培养基中进行主培养(mainculture)。在培养至对数生长期之后，通过离心(12000xg,4°C，15分钟)从50ml培养液收获细胞。根据常规方法从这些细胞制备了染色体DNA。(2)通过PCR获得Wo基因基于公开的关于蜡状芽孢杆菌ATCC14579的基因组序列信息(GenBank登录号AE016877)，合成了以下引物CATATGGAGGTTTTTATAATGACGTTTGTT(SEQIDNO:10)通过使用制备的引物和蜡状芽孢杆菌ATCC14578的染色体DNA作为模板，使用PrimeSTAR(TaKaRa)在以下条件下进行了PCR扩增30个循环的98°C10秒，52。C15秒和72。C1分钟。对获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并且观察到扩增了约750bp的片段。收集所述DNA片段，用AWeI和屈oI内切核酸酶消化，并且克隆入已经用相同的内切核酸酶消化的表达载体pET21b(Novagene)中。然后测定核苷酸序列并且推导其编码氨基酸序列(SEQIDNO:12和13)。结果，基于所得DNA片段的同源性确认获得了同源Wo基因。相对于源自以色列苏云水平的同源性是98%,并且相对于源自苏云金芽孢杆菌2-e-2的Wo基因在核香酸序列水平的同源性是98%。至于苏云金芽孢杆菌AKU238，通过用于从苏云金芽孢杆菌2-e-2克隆/^基因的引物(SEQIDNO:14和15)，通过PCR克隆了^fo基因并且按照与上文相似的方式测序(SEQIDNO:16和17)。相对于源自以色列苏云金芽孢杆菌的/必基因在核苦酸序列水平的同源性是98%,并且相对于源自苏云金芽孢杆菌2-e-2的Wo基因在核苷西拼列水平的同源性是98%。CTCGAGTTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGT(SEQIDNO:15)至于韦氏芽孢杆菌KBAB4，通过基于公开的关于韦氏芽孢杆菌KBAB4(GenBank登录号NZ—AAOYO100000l)的基因组序列信息的引物，合成了以下引物(SEQIDNO:18和19)，通过PCR克隆了Wo基因并且按照与上述相似的方式测序(SEQIDNO:20和21)。相对于源自以色列苏云金芽孢杆菌的Wo基因在核苷酸序列水平的同源性是78%,并且相对于源自苏云金芽孢杆菌2-e-2的Wo基因在核苷酸序列水平的同源性是78%。CATATGCTAACAACAGTTTCTAATAAGACA(SEQIDNO:18)实施例9.在大肠杆菌中表达Wo基因和从lie产生HIL(1)大肠杆菌中/cfo基因的表达将实施例8中构建的表达源自蜡状芽孢杆菌ATCC14579、苏云金芽孢杆菌AKU238或韦氏芽孢杆菌KBAB4的Wo基因的质粒导入大肠杆菌Rosetta2(DE3)，并且将所得转化体在振荡条件下在补充有50吗/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养(预培养)。将预培养液以1%接种至50mlLB培养基中，在37。C进行主培养。在培养起始之后2小时，以终浓度1mM添加IPTG，并且将培养再进行3小时。培养完成之后，将细胞收获、洗涤、悬浮在1ml的20mMTris-HCl(pH7.6)中，并且用超声仪(INSONATOR201M,KUBOTA)使其石皮裂。将裂解物在15000rpm离心10分钟以获得上清液，将所述上清液用作粗制酶溶液。(2)使用粗制酶溶液从lie产生HIL使用(l)中制备的粗制酶溶液，测量将Ile转化为HIL的活性。反应混合物具有如下所述的组成。将所述反应混合物在振荡条件下(300rpm)在28°C反应3小时，然后通过HPLC测定产生的HIL。测定结果示于表14。反应混合物细胞裂解物(超声破裂)500|il2%lielOQfil1Ma-KG，(xl1M抗坏血酸？(il0.1MFeCl2lp(il1MKPB(pH6)_10Qpi总计1ml表14从异亮氨酸产生HIL的量HILC以色列苏云金芽孢杆菌ATCC356462150苏云金芽孢杆菌2e22321苏云金芽孢杆菌AKU2382016蜡状芽孢杆菌ATCC1457990韦氏芽孢杆菌KBAB43116对照(pET21b)11结果，当使用表达源自蜡状芽孢杆菌ATCC14579的Wo基因的菌抹和表达源自苏云金芽孢杆菌AKU238或韦氏芽孢杆菌KBAB4的Wo基因的质粒时，清楚地观察到HIL的产生。由此，确认了这些基因可用于HIL产生。序列说明1:源自苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2的IDO基因的核苷酸序列2:源自苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2的IDO的氨基酸序列3:引物svsl70;用于扩增IDO基因4:引物svsl69;用于扩增IDO基因5:源自苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2的IDO的N-末端序列6:芽孢杆菌属中的IDO保守序列7:源自苏云金芽孢杆菌菌林ATCC35646的IDO基因的核普酸序列8:源自苏云金芽孢杆菌菌抹ATCC35646的IDO的氨基酸序列9:苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2的16SrDNA核苷酸序列10:用于从蜡状芽孢杆菌ATCC14579扩增IDO基因的引物11:用于从蜡状芽孢杆菌ATCC14579扩增IDO基因的引物12:源自蜡状芽孢杆菌ATCC14579的IDO基因的核普酸序列13:源自蜡状芽孢杆菌ATCC14579的IDO的氨基酸序列14:用于从苏云金芽孢杆菌AKU238扩增IDO基因的引物15:用于从苏云金芽孢杆菌AKU238扩增IDO基因的引物16:源自苏云金芽孢杆菌AKU238的IDO基因的核苷酸序列17:源自苏云金芽孢杆菌AKU238的IDO的氨基酸序列18:用于从韦氏芽孢杆菌KBAB4扩增IDO基因的引物19:用于从韦氏芽孢杆菌KBAB4扩增IDO基因的引物20:源自韦氏芽孢杆菌KBAB4的IDO基因的核苷酸序列21:源自韦氏芽孢杆菌KBAB4的IDO的氨基酸序列工业实用性根据本发明，提供了使用酶产生4-羟基异亮氨酸的方法，所述酶源自微生物并且催化通过直接羟化异亮氨酸而产生4-羟基异亮氨酸的反应。本发明在药物和食品领域非常有用。本发明的L-异亮氨酸双加氧酶是一种新的双加氧酶，其催化L-异亮氨酸的羟化反应，并且可以优选地用于合成(2S,3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，(2S，3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸可以用作具有促胰岛素活性的药物组合物的成分。权利要求1.一种产生4-羟基异亮氨酸或其盐的方法，包括产生4-羟基异亮氨酸的步骤，其中通过使异亮氨酸或其盐在源自微生物的羟化酶存在下进行羟化反应并从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸。2.根据权利要求1的产生方法，其中所述微生物是属于芽孢杆菌属的微生物。3.根据权利要求2的产生方法，其中所述属于芽孢杆菌属的微生物是选自以下的微生物苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和韦氏芽孢杆菌。4.根据权利要求1-3中任一项的产生方法，其中所述鞋化反应在制备自对数生长期的微生物细胞的细胞裂解物存在下进行。5.根据权利要求1-4中任一项的产生方法，其中对L-异亮氨酸进行羟化反应。6.根据权利要求1-5中任一项的产生方法，其中所述羟化酶是双加氧酶。7.根据权利要求1-6中任一项的产生方法，其中所述羟化酶具有以下特性(a)需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b)最适反应pH为5-8，(c)最适反应温度为45°C或更低，(d)在S0。C或更高失活，(e)受到EDTA、Cu2+和Zn2+抑制。8.—种双加氧酶，其具有以下特性并且可以从芽孢杆菌属细菌分离(a)需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b)最适反应pH为5-8，(c)最适反应温度为45°C或更低，(d)在S0。C或更高失活，(e)受到EDTA、Cu2+和Zn2+抑制，(f)如通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量，包含分子量为29000±2000的亚基，(g)在N末端具有SEQIDNO:5的#^酸序列。9.根据权利要求8的双加氧酶，其中所述芽孢杆菌属细菌是苏云金芽孢杆菌。10.—种选自下组的DNA:(a)包含SEQIDNo:1的核苦酸序列的DNA;(b)在严紧条件下与具有SEQIDNo:1核苦酸序列的互补核香酸序列的DNA杂交并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA;(c)编码包含SEQIDNo:2的氨基i^f列的蛋白质的DNA;(d)编码具有如下^JJ臾序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA,所述^Il&酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(e)编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA，所述氨基S交序列与SEQIDNo:2的^i^酸序列是至少98%同源的。11.一种重组DNA，其通过将根据权利要求10的DNA与载体DNA连接获得。12.—种由根据权利要求11的重组DNA转化的细胞。13.—种用于产生具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的方法，其包括将根据权利要求12的细胞在培养基中培养，和在培养基和/或细胞中积累具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。14.一种选自下组的蛋白质(f)包含SEQIDNo:2的氨基Sl^列的蛋白质；(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(h)与SEQIDNo:2的氨基酸序列至少98%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。15.—种蛋白质，其包含(A)具有催化通过L-异亮氨酸的羟化产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的反应的活性；(B)所述活性依赖于二价阳离子Fe2、并且(C)如通过SDS-PAGE测量，分子量是约29±2.0kDa。16.—种用于制备(2S，3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，包括步骤在选自下组的至少一种L-异亮氨酸双加氧酶存在下，使L-异亮氨酸在水性溶剂中反应(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的絲酉Uf列的蛋白质，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基酉l/f列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酉饼歹'J中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)与SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质；分离产生的(2S，3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。17.—种用于制^(2S，3R，4S)-4-雍基-L-异亮氨酸或其盐的方法，包括步骤在包含选自下组的L-异亮氨酸双加氧酶的细菌存在下，使L-异亮氨酸在水性溶剂中反应(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酉l/f列的蛋白质，(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的#^酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，和(h)与SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质；和分离产生的(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。18.根据权利要求17的方法，其中所述细菌经修饰以增强L-异亮氨酸双加氧酶活性。19.根据权利要求18的方法，其中L-异亮氨酸双加氧酶的活性通过增加编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达来增强。20.根据权利要求19的方法，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达通过修饰编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达调控序列或通过增加编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的拷贝数来增加。21.根据权利要求18-20中任一项的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、曲霉属或芽孢杆菌属。22.根据权利要求21的方法，其中所述细菌属于大肠杆菌、简单节杆菌、谷氨酸棒杆菌、球形节杆菌、硫磺节杆菌、粘液节杆菌或枯草芽孢杆菌。23.根据权利要求18-22中任一项的方法，其中所述细菌是细菌培养物、细胞、经处理细胞或细胞裂解物。全文摘要本发明提供来自苏云金芽孢杆菌的新的高活性L-异亮氨酸双加氧酶。还提供一种制备(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，该方法包括在L-异亮氨酸双加氧酶存在下使L-异亮氨酸在水性溶剂中反应，和分离产生的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。文档编号C12P13/06GK101528940SQ20078003630公开日2009年9月9日申请日期2007年9月28日优先权日2006年9月28日发明者小寺智博,小川顺,尤里·I·科兹洛夫,日比慎,清水昌,瑟奇·V·斯米尔诺夫,纳塔利亚·N·萨姆索诺瓦,纳塔利亚·Y·拉什克维克,维罗尼卡·A·科特利亚罗瓦申请人:味之素株式会社