一种调控1,4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊二烯转移酶活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物菌种改造领域，具体涉及一种调控1，4-二羟基-2-萘甲 酸-聚异戊二烯转移酶活力的方法。
【背景技术】
[0002] 4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶（UbiA)是细菌体内一种用来催化4-羟基-萘 甲酸和侧链聚异戊二烯生成3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸的酶，该酶活力的提高可以显著 增强细菌辅酶Q(Co?的合成能力，并且该酶对聚异戊二烯焦磷酸的专一性不强，可接受不 同数目的异戊二烯。将ubiA基因克隆，并装载于光合细菌启动子下游，可以实现其在光合 细菌中的大量表达，增强光合细菌对羟苯甲酸聚异戊二烯转移酶的活性，使光合细菌体内 C〇Q1(l的含量大幅增加。
[0003] 1，4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊二烯转移酶（MenA)是细菌体内一种用来催化 1,4-二羟基-2-萘甲酸（DHNA)和侧链聚异戊二烯生成去甲基维生素1(2的关键酶，有研宄 表明，menA基因的过表达能将大肠杆菌合成维生素K2的能力提高2倍，远远高于单独过表 达men家族的其它基因。因此，该酶活力的调节对于细菌合成维生素K2至关重要。
[0004] 辅酶Q与维生素1(2拥有共同的侧链合成途径，竞争同一个侧链底物。因此，ubiA 基因的表达不利于菌体内维生素K2的合成。然而，ubiA基因的彻底敲除又会抑制菌体的生 长。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术的不足，本发明提供一种调控1，4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊 二烯转移酶活力的方法，降低了聚异戊二醇菌体内代谢流向辅酶Q的合成，通过调节4-羟 苯甲酸-聚异戊二烯转移酶（UbiA)基因的表达，进而影响菌体内1，4-二羟基-2-萘甲 酸-聚异戊二烯转移酶（MenA)的活力。
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供一种调控1，4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊二烯转 移酶活力的方法，包括如下步骤：
[0007] a.将纳豆芽孢杆菌在LB液体培养基中培养；
[0008] b.提取纳牙抱杆囷全基因组；
[0009] C.以4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶基因为目的基因设计引物对，对纳豆芽孢杆 菌全基因组进行PCR扩增目的基因片段；
[0010] d.将目的基因片段与载体连接构建用于抑制1，4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊二 烯转移酶活性的干扰载体；
[0011] e.干扰载体转化纳豆芽孢杆菌，并利用载体上的抗性基因筛选转化子，将筛选到 的一株转化子转接到斜面培养基上以备检测；
[0012] f.从斜面培养基上挑取菌落在种子培养基上进行培养突变株；
[0013] g.将原纳豆芽孢杆菌及突变株分别接入发酵培养基中，检测各菌株的生长情况， 在培养基中培养5-7天，测定发酵液维生素K2含量，并采用反转录PCR或荧光定量PCR检 测各菌株4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶和1，4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊二烯转移酶 表达水平。
[0014] 优选的，所述在LB液体培养基和发酵培养基中培养均处于37°C温度条件。
[0015] 所述步骤c中目的基因片段两侧加有限制性内切酶的酶切位点和保护碱基序列。
[0016] 优选的，所述步骤d中的载体为基因敲除载体或沉默载体。
[0017] 所述步骤e中干扰载体转化纳豆芽孢杆菌的方式可以为电激转化、采用聚乙二醇 介导的原生质体转化、异丙醇转化或二甲基亚砜转化。其中采用聚乙二醇介导的原生质体 转化和二甲基亚砜转化的方式能够使维生素1( 2含量得到提高。
[0018] 优选的，所述步骤g中菌株的生长情况采用BioscreenCMBR自动微生物生长分 析仪实时监测。
[0019] 优选的，所述步骤g中测定发酵液维生素1(2含量采用HPLC进行测量，荧光定量PCR 检测采用SYBRGreenReal-TimeqPCR试剂盒进行检测。
[0020] 所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶基因是SEQIDNo:1所示的碱基序列。
[0021] 所述1，4_二羟基_2_蔡甲酸-聚异戊二條转移酶基因是SEQIDNo:2所不的喊 基序列。
[0022] 所述步骤c中的引物对为SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列。
[0023] 本发明具有以下有益效果：本发明通过分子生物学手段调控纳豆芽孢杆菌ubiA 基因的表达水平，获得一株ubiA基因下调突变株；本发明获得的突变株菌体生物量比原始 菌略有下降；进入发酵对数生长期后menA转录水平明显提高，维生素1(2产量也有明显提 高。该方法通过抑制纳豆芽孢杆菌中4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶（UbiA)的活力，降 低了聚异戊二醇菌体内代谢流向辅酶Q的合成。更为重要的是，通过ubiA基因的调节，也 影响了菌体内1，4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊二烯转移酶（MenA)的活力，从而直接影响 了纳豆芽孢杆菌合成维生素K2的能力。本发明为维生素1(2优良菌株的选育提供了一条新 思路，在食品、生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1为各突变株采用反转录PCR测得ubiA基因的不同表达水平；
[0025] 图2为各突变株采用荧光定量PCR测得ubiA基因的不同表达水平。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变 动都在本发明的范围之内。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0027] 实施例一
[0028] 以纳豆芽孢杆菌MH-1为出发菌株，依次按照下列步骤进行操作：
[0029] 1、将纳豆芽孢杆菌培养在50mLLB培养基中37°C摇床培养48h。
[0030] 2、收集培养液，离心后收集菌体沉淀，用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20°C。
[0031] 3、以4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶基因ubiA为目的基因，设计引物对如下：
[0032]Primer-F5,-ATATACTCGAGATGATCAAGTTCGAGCACAC3,（SEQIDNo:3)
[0033]Primer-R5'-GGCAACCATGGTCATATAAACATATCTCCTA3'（SEQIDNo:4)
[0034] 以基因组DNA为模板，用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增，目的片段约为834bp。
[0035] 4、将载体pHN678转化大肠杆菌感受态细胞后涂布于含氯霉素抗性的平板上，于 37°C恒温培养箱中培养过夜（12-16h)。从转化平板中挑取单菌落，液体培养后用质粒提取 试剂盒提取质粒后保存于_20°C。
[0036] 5、分别将载体与目的片段用Ncol酶切后，在T4DNA连接酶作用下连接成干扰载体 pHNU〇
[0037] 6、获得的干扰载体利用热激法转化纳豆芽孢杆菌，利用30yg/mL氯霉素抗性筛 选转化子。筛选到的一株转化子转接到斜面培养基上以备检测。
[0038] 7、从斜面培养基上挑取菌落至40mLLB种子培养基中进行培养，于37°C恒温培养 箱中培养48h。
[0039] 8、将原纳豆芽孢杆菌及种液分别按5%的接种量接入含50mL发酵培养基的500mL 锥形瓶中，37°C下220r/min培养6天。培养过程中采用Bioscreen C MBR自动微生物生长 分析仪实时监测菌株生长状况。摇瓶发酵培养基（w/v% )成分为：甘油6.96,鹿糖3. 45， K2HP044,蛋白胨2,酵母提取物2. 5, pH7. 3,500mL三角瓶装液量为50mL，摇床转速为150r/ min，37°C培养72h后菌体生物量能达到1. 9-3.6g/L。
[0040] 9、发酵结束后，HPLC检测菌体中维生素K2含量比原始菌降低了 23%，采用SYBR GreenReal-TimeqPCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，测得该菌株ubiA表达水平降低了 41 %，menA表达水平比原始菌降低了 21-25 %，也可以采用反转录PCR定性的反映菌株ubiA 表达水平以及menA表达水平。
[0041] 实施例二
[0042]以纳豆芽孢杆菌MH-1为出发菌株，依次按照下列步骤进行操作：
[0043]1、将纳豆芽孢杆菌培养在50mL LB培养基中37°C摇床培养48h。
[0044] 2、收集培养液，离心后收集菌体沉淀，用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20°C。
[0045]3、以4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶基因ubiA为目的基因，设计引物对如下：
[0046] Primer-F 5' -ATATA CTCGA GATGA TCAAG TTCGA GCACA C 3' (SEQ IDNo：3)
[0047]Primer-R5'-GGCAACCATGGTCATATAAACATATCTCCTA3'（SEQIDNo:4)
[0048]以基因组DNA为模板，用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增，目的片段约为834bp。
[0049] 4、将载体pHN678转化大肠杆菌感受态细胞后涂布于含氯霉素抗性的平板上，于 37°C恒温培养箱中培养过夜（12-16h)。从转化平板中挑取单菌落，液体培养后用质粒提取 试剂盒提取质粒后保存于_20°C。
[0050] 5、分别将载体与目的片段用Ncol酶切后，在T4DNA连接酶作用下连接成干扰载体 pHNU〇
[0051] 6、获得的干扰载体利用聚乙二醇介导的原生质体转化方法转化纳豆芽孢杆菌，利 用40yg/mL氯霉素抗性筛选转化子。筛选到的一株转化子转接到斜面培养基上以备检测。
[0052] 7、从斜面培养基上挑取菌落至40mLLB种子培养基中进行培养，于37°C恒温培养 箱中培养48h。
[0053] 8、将原纳豆芽孢杆菌及种液分别按5%的接种量接入含50mL发酵培养基的500mL 锥形瓶中，37°C下220r/min培养6天。培养过程