粉红单端孢菌及其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，设及一种植物内生真菌在生防领域中的应用，特别 设及植物内生真菌曲/Wfeu曲TR-1或其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应 用。
【背景技术】
[0002] 粉红单端抱菌（7>icAwAeci細？rase細？LinkRries)属真菌口、半知菌类、丛 梗抱目、丛梗抱科、双胞亚科、单端抱菌属。r.rosw/??与人们的生产、生活关系密切，主要表 现在几个方面：（1)该菌可引起多种作物病害，如木瓜果腐病、穗醋栗红粉病、板栗实腐 病、香蕉和葡萄红粉病、棉花红粉病、苹果霉屯、病、套袋鸭梨黑点病、番茄红粉病及玉米粉红 聚端抱穗腐病等；（2)该菌产生的次级代谢产物一粉红单端抱毒素，可导致食品毒素污染； 做r.rosww作为植物病害的生防因子也备受人们关注，目前已报道其发酵液在玉米小斑 病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、烟草赤星病、西瓜枯萎病油菜菌核病和棉花黄萎病都具有一 定抑菌效果；因此，对r.rosw公fe防特征的深入了解，有助于人们对其致害性的科学防控 及其有益特性的充分利用。目前关于该菌对小麦白粉病菌的活性国内外鲜有报道。
【发明内容】
[0003] 本发明人从草替中分离的一株内生真菌化icAofAeci歴rose歴LinkexRries， 并发现其具有括抗小麦白粉病菌的生物活性。因此，本发明的目的在于提供内生真菌 巧及其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用。
[0004] 为了实现本发明的目的，发明人从草替根茎部中分离到一株内生真菌TR-1，并对 其进行了分类鉴定，将菌株代号命名为TR-1，于2015年5月29日保藏在中国典型培养物 保藏中屯、(地址：中国武汉塔挪山武汉大学)，保藏号：CCTCCNO:M2015344,TR-1鉴定为 TrichotheciumroseumW_\。 阳0化]另外，本发明人对所分离的内生真菌TR-1做了进一步的形态学、同源性、培养方 法和生物活性等方面的特征进行了研究，具体结果如下： 1、内生真菌TR-1的形态特征 (1)菌落形态：TR-1在马铃馨-葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseagar,PDA)上 25°C培养4d后在光学显微镜下观察照片，在PDA培养基上菌丝的菌落中央为粉红色且边缘 呈白色绒毛状。其菌落形态特征见图1。
[0006] (2)抱子形态：分生抱子长圆形或洋梨形，双细胞，无色，抱基具偏乳头突起，分生 抱子大小长18. 0~19. 2ym(平均18. 5ym)，宽8. 4~9. 6ym(平均9. 0ym); 抱子多点出芽其有性形态特征见图2。
[0007] 2、粉红单端抱TR-1菌株滤液的制备 在250血的S角瓶中加入150血的PDB液体培养基，经高压灭菌后接入粉红单端抱病 菌菌丝5块(直径约为5cm)，在25°C恒溫摇床震荡黑暗培养15d。用纱布过滤培养液，除去 菌丝及抱子，取过滤液过0. 22ym细菌滤膜，滤液即为粉红单端抱备用滤液。
[000引 3、不同稀释倍数的TR-1菌株滤液对小麦白粉菌的活性 采用离体叶段法，将培养至1叶1屯、的小麦，第1叶剪成30mm长叶段，置于含50ug/ml苯拼咪挫的0. 5%的水琼脂平板上，每皿(直径60mm)摆放8片叶段。加入表面活性剂吐溫 20 (终浓度为2. 5X10 4)与发酵液充分混匀，在喷雾塔中施用，喷雾量4ml。设置6个处理， 分别为TR-1菌株滤液4ml，3ml，2ml，1ml，0. 5ml和0ml，剩余的用无菌水补足4ml。同时喷 施含2. 5X10 4吐溫20的PDB溶液处理为阴性对照，喷施清水为空白对照，自然惊干，24h 后接种小麦白粉病菌分生抱子(接种量为15个分生抱子/10倍视野)。然后放在17 ±rc的 空调房中培养，先避光12h，然后在24小时40W日光灯照射下(培养室）培养，结果见图3。
[0009] 4、内生真菌发酵液萃取物对小麦白粉菌活性测定 内生真菌TR-1液体发酵培养7天，得总发酵液，经离屯、或过滤得菌丝和菌液部分，用乙 酸萃取，浓缩成浸膏，得到乙酸提取物。准确称取TR-1菌株发酵液的乙酸提取物0.Olg，并 加入10mL无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置成浓度为1000mg/L的母液。采用离体 叶段法，将母液配置成10mg/L的工作液，用化ter喷雾塔均匀喷施到小麦离体叶段上，自 然惊干，24小时后接种新鲜的小麦白粉病菌，另设阴性对照组化酸处理)和空白对照组(纯 水处理)，置于17°C培养室进行培养。7天后调查发病情况，结果见图4。
[0010] 本发明的优点：本发明从草替中分离到一株内生真菌化icAWAeciu曲roseu曲 TR-1，并发现其对小麦白粉菌具有较高的括抗活性，从而可将内生真菌TR-1作为生防菌应 用于小麦白粉菌引起的植物疾病的防治中。另外，由于内生真菌TR-1发酵液的乙酸萃取物 具有更高的生防活性，因此可W继续利用该植物内生真菌资源获得天然生物活性物质，为 其开发和应用W及探讨内生真菌的生理生态功能提供依据。
【附图说明】 |；0〇11] 图1为曲rase歴TR-1的菌落形态特征。 阳〇1引 图2为曲rose歴TR-1的抱子形态特征。
[001引 图3为曲raseuM'R-l的发酵滤液对小麦白粉菌的活性测定结果，从 上向下依次为TR-1菌株滤液的4ml，3ml，2ml，1ml，0. 5ml和0ml处理。
[0014] 图4为fAeciu曲的发酵液萃取物对小麦白粉菌活性测定结果。 从左到右依次为乙酸萃取相，乙酸乙醋萃取相，阴性CK。
【具体实施方式】
[0015] W下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明 的保护范围并不限于运些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发 明的保护范围之内。
[0016] 实施例1:本发明所述粉红单端抱TR-1的分离及鉴定 将采集新鲜植物的各部分组织在流水下冲洗，除去表面附着的泥沙，放入4°C冰箱保 存。内生真菌的分离采用常规组织分离法，样品先用无菌水清洗2次，将样品切成1~2cm 长小段放入75%酒精中浸泡1~2min(根据分离部位确定时间长短)，用无菌水冲洗2~3 次.再用1. 5%有效氯含量的次氯酸钢消毒7~lOmin，用无菌水冲洗3次，将表面消毒的 组织在灭菌的培养皿中用灭菌的刀片切成0. 2cmX0. 2cm的片段，用灭菌滤纸将消毒组织 块表面的水分充分吸干。最后将组织块移植到PDA培养基（含50U/mL硫酸链霉素和氨节 青霉素）平板上，置25°C恒溫培养箱中避光培养。每隔1天进行观察，及时挑取切口处长出 的新鲜菌丝，转接到新的PDA平板培养进行编号保存。采用离体叶段法测定菌株其对小麦 白粉菌抑制作用，选择活性的菌株，命名为菌株TR-1。结合常规的形态学鉴定和分子鉴定将 其鉴定为粉红单端抱。
[0017] 实施例2:本发明所述的TR-1菌株不同滤液对小麦白粉菌的活性 采用离体叶段法，将培养至1叶1屯、的小麦，第1叶剪成30mm长叶段，置于含50ug/ml苯拼咪挫的0. 5%的水琼脂平板上，每皿(直径60mm)摆放8片叶段。加入表面活性剂吐溫 20 (终浓度为2. 5X10 4)与发酵液充分混匀，在喷雾塔中施用，喷雾量4ml。设置6个处理， 分别为TR-1菌株滤液4ml，3ml，2ml，1ml，0. 5ml和0ml，剩余的用无菌水补足4ml。同时喷 施含2. 5X10 4吐溫20的PDB溶液处理为阴性对照，喷施清水为空白对照，自然惊干，24h 后接种小麦白粉病菌分生抱子(接种量为15个分生抱子/1〇倍视野)。然后放在17 ±rc的 空调房中培养，先避光12h，然后在24小时40W日光灯照射下(培养室)培养。结果见表1。
[0018] 表1粉红单端抱TR-1无菌滤液对小麦白粉菌的活性
实施例3:本发明所述的TR-1菌株发酵液萃取物对小麦白粉菌活性测定 发酵终止后过滤发酵产物，滤液于ll〇(K)r/min离屯、lOmin，取上清液，将有活性发酵液 进行冷冻干燥，获得干粉依次用乙酸和乙酸乙醋等体积萃取，萃取5次，每次lOmin。将有机 相收集，旋蒸浓缩成浸膏备用。水相回收。取LPS-1菌株发酵产物萃取物，将其配成lOmg/ L进行活性测定。采用离体叶段法，喷雾量为350mL/m2,自然惊干，24小时后接种新鲜的小 麦白粉病菌，另设溶剂处理为阴性对照和空白对照。置于17°C培养室进行培养。7天后调 查发病情况。
[0019] TR-1菌株发酵液萃取物对小麦白粉菌活性
【主权项】
1. 一种粉红单端孢菌rase?TR-I及其发酵产物在防治小麦白粉菌中 的应用。2. 根据权利要求1所述的一种粉红单端孢菌7>icAoMeci?rase?TR-I及其发酵产 物在防治小麦白粉菌中的应用，其特征在于rase?TR-I于2015年5月 29日包藏于中国典型培养物包藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2015344。
【专利摘要】本发明涉及微生物技术领域，本发明所述的内生真菌是从草莓中分离获得，经微生物分类学鉴定，命名粉红单端孢<i>Trichothecium</i><i>？roseum</i>？TR-1,该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国？武汉？武汉大学），保藏号：CCTCC？NO:？M？2015344。本发明最显著的特征是菌株液体发酵液及其乙醚萃取物都对小麦白粉菌有抑制作用，抑制效果达。该发明为<i>Trichothecium</i><i>？roseum</i>的进一步研制和开发提供优良的出发菌株，是农业上重要的微生物资源。CCTCC NO: M 201534420150529
【IPC分类】A01N63/04, A01P3/00
【公开号】CN105211105
【申请号】CN201510682692
【发明人】喻大昭, 龚双军, 向礼波, 杨立军
【申请人】湖北省农业科学院植保土肥研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日