一株生防芽孢杆菌的固相发酵方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明涉及一株生防芽孢杆菌的发酵方法，尤其是一种生防芽孢杆菌的固态发酵方 法，属于发酵工业领域。
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【背景技术】： 生产优质、安全的农产品是人们对农业的要求，农业也面临着由化学时代向无公害、绿 色和有机时代的过渡。目前，在我国由于农产品中大量农药残留，导致急性或慢性中毒事件 时有发生，少量农药进入人体也损害机体健康诱发多种疾病，化学农药的长期大量使用还 造成了水土资源的严重污染。发展生态农业，生产绿色、安全食品已成为大势所趋。微生物 生防制剂是当前国家提倡应用于防治植物病害的农用生物制剂，具有如下特点：⑴安全环 保；⑵可持续控制有害生物；⑶对土传病害的防治效果优于化学农药。我国"十二五"规划 对环境资源保护和人民生活健康水平等方面提出更高要求，减少化学农药使用，大力发展 生物制剂势在必行，这是促进农业可持续发展的迫切问题。
[0003] 目前，微生物生防制剂与化学农药相比防治成本较高是阻碍其推广应用的一个重 要原因。因此从提高微生物生防制剂的发酵水平着手，降低发酵成本以促进其推广是迫切 需要解决的问题。这一研究方向符合现代农业可持续发展的需求，符合植物病害可持续治 理的的目标，对提高食品安全和环境健康等方面具有重要意义，具有良好的经济、生态和社 会效益。芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，具有良好生防潜能及商品性 能，是重要的生防菌资源。生防芽孢杆菌具有以下优点：高效，杀菌谱广；具有预防和治疗 的双重作用，在发病前使用可保护植株免受病原菌的侵染，在发病后酌量使用可控制病害 蔓延，优于传统的三环唑；对环境和作物安全；剂型合理，固体制剂具有活菌数多、携带方 便、实用性强、保质期长等优点；价格适中，节约成本，具有明显的经济效益；从多方位点进 行杀菌抑菌，病原难以产生抗药性；抗逆性强，对高温、酸碱和紫外线耐性较强，有广阔的应 用前景；诱导作物产生抗病性。此外，它还可以在作物表面产生一些植物生长调节素类物质 如分裂素、吲哚乙酸等，促进植物生长，提高产量。作为一种较为理想的生防菌，枯草芽孢杆 菌目前已在水稻、玉米、小麦、大豆、辣椒、棉花、番茄等农作物上显示出较好的防治效果。目 前，国内外已有一些枯草芽孢杆菌研制成为生物农药投放到市场上，如我国大面积推广应 用的增产菌系列产品就是由多种芽孢杆菌组成的混合菌剂，在全国推广应用多年，累计应 用面积超过10亿亩耕地，取得良好的抗菌防病效果。
[0004] 目前，市场上的枯草芽孢杆菌制剂多采用液相深层发酵技术。液相深层发酵，投资 大，成本高，技术要求高，产生废液多，污染严重。而固相发酵，整个发酵过程跟微生物在自 然环境中所发生的微生物反应相似，固相发酵工艺相比液相发酵具有以下特点：⑴生产成 本低，固相发酵工艺可以利用工农业生产中的副产品进行发酵，避免了液相发酵原材料价 格较高的不足。以农产品加工过程中的副产物做固相发酵基质，不仅提高了农产品加工副 产物的利用价值，还具有巨大的经济效益；⑵发酵终产物中菌体含量高。固相发酵终产物中 菌体含量能达到l〇 nCFU/g水平，而液相发酵终产物中菌体含量基本在101° CFU /ml水平； ⑶没有废物排放；⑷发酵过程能耗低。固相发酵避免了液态发酵的不足，适宜工业化生产， 日益受到人们的重视。
[0005] 本发明中，我们利用农产品加工过程中的副产物麦麸、豆渣、菇渣作为生防芽孢杆 菌固体发酵基质，优化生防芽孢杆菌的固相发酵工艺，提高发酵水平，从而降低生产成本， 促进生防菌剂的推广使用，以达到减少化学农药使用的目的。这一固相发酵技术对于除了 生防芽孢杆菌以外的其他生防细菌的固态发酵具有非常大的借鉴意义，从而能更好的促进 生防菌剂的推广使用，而且对提高食品安全和环境健康等方面具有重要意义，具有良好的 经济、生态和社会效益。
【发明内容】
[0006] 本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种生防芽孢杆菌利用农产 品加工过程中的副产物进行固态发酵的方法。为了达到上述目的，本发明采取了以下技术 方案。
[0007] -株生防芽孢杆菌的固相发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：制备生防芽孢杆 菌的种子液；以体积质量比5~15ml/100g将所述种子液接入到固相发酵培养基中，在温度 25~37°C，相对湿度50~90%，PH 6. 2~8. 5条件下培养48~72小时，得到生防芽孢杆 菌的固相发酵产物，其中所述固相发酵培养基由农产品加工过程中的副产物、碳源、氮源、 盐和水按质量比1 :(〇· 1~0.7):(0. 17~1. 1):(0.01~0.05) :(1.2~6. 4)混合组成， 高压湿热灭菌〇. 5~1小时，冷却后得到。
[0008] 本发明公开的以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法与现有技术相比所具 有的积极效果在于： 本发明提供的一株生防芽孢杆菌的固相发酵方法有效的提高了生防芽孢杆菌的固相 发酵水平，降低生产成本，对生产工艺和设备要求低，有益于实现生防芽孢杆菌的工业化生 产，促进生防菌剂的使用，减少化学农药的使用；有效解决了液相深层发酵投资大，成本高， 技术要求高，产生废液多，污染严重的问题，有益于环境保护；由于使用农产品加工过程中 的副产物作为固相发酵载体，可以循环利用，减少了固相发酵废渣的排放量，有利于环保。
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【具体实施方式】： 在本发明的各实施例中使用的菌株是生防芽孢杆菌菌株TB1335,保存于天津市植物保 护研究所农业微生物发酵研究室，对外可免费提供。
[0010] 〈实施例1> (1)将生防芽孢杆菌TB1335接种在LB平板培养基上，培养温度为37°C，培养24h，之后 接种于液态LB培养基中。液态种子培养条件为：培养温度37°C，摇床转速160r/min，PH7. 2， 培养时间16h，得到种子液。
[0011] (2)将麦麸、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按质量比1 : 0. 22:0. 08:0. 09: 0. 01:1. 2加入250ml锥形瓶中，调PH6. 8,高压湿热灭菌0. 5h，冷却至室 温，接入6%质量份的种子液，混合均匀，28°C，相对湿度60%条件下培养48h。
[0012] (3)发酵产物处理：发酵结束后，发酵产物用于分析发酵水平，分析后将固态基质 烘干可以回用于固体发酵。
[0013] 〈实施例2> (1)将生防芽孢杆菌TB1335接种在LB平板培养基上，培养温度为37°C，培养24h，之后 接种于液态LB培养基中。液态种子培养条件为：培养温度37°C，摇床转速160r/min，PH7. 2， 培养时间16h，得到种子液。
[0014] (2)将麦麸、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按质量比1 :0. 5:0. 16:0. 13: 0. 03:1. 7加入250ml锥形瓶中，调PH6. 8,高压湿热灭菌0. 5h，冷却至室温，接入6%质量份 的种子液，混合均匀，28°C，相对湿度60%条件下培养48h。
[0015] (3)发酵产物处理：发酵结束后，发酵产物用于分析发酵水平，分析后将固态基 质烘干可以回用于固体发酵。
[0016] 〈实施例3> (1)将生防芽孢杆菌TB1335接种在LB平板培养基上，培养温度为37°C，培养24h，之后 接种于液态LB培养基中。液态种子培养条件为：培养温度37°C，摇床转速160r/min，PH7. 2， 培养时间16h，得到种子液。
[0017] (2)将麦麸、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按质量比1 :0.7:0. 6:0. 5: 0. 05:5加入250ml锥形瓶中，调PH6. 8,高压湿热灭菌0. 5h，冷却至室温，接入6%质量份的 种子液，混合均匀，28 °C，相对湿度60%条件下培养48h。
[0018] (3)发酵产物处理：发酵结束后，发酵产物用于分析发酵水平，分析后将固态基质 烘干可以回用于固体发酵。
[0019] 〈实施例4> (1)将生防芽孢杆菌TB1335接种在LB平板培养基上，培养温度为37°C，培养24h，之后 接种于液态LB培养基中。液态种子培养条件为：培养温度37°C，摇床转速160r/min，PH7. 2， 培养时间16h，得到种子液。
[0020] (2)将麦麸、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按质量比1 :0. 5:0. 16:0. 13: 0. 03:1. 7加入250ml锥形瓶中，调PH7. 5,高压湿热灭菌