解淀粉芽孢杆菌b1619的发酵培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及解淀粉芽孢杆菌B1619的发酵培养方法，属于利用有益微生物对设施 茄科蔬菜进行生物防治的领域。
【背景技术】
[0002] 设施蔬菜是现代农业生产的支柱产业，在国民经济中具有重要的发展地位。随着 设施蔬菜种植面积的增大和连年种植，土传病害呈逐年加重趋势，已成为设施蔬菜产业化 生产的瓶颈。一些地区的大棚连续多年种植后，由于土传病害可减产10% -15%，严重时达 30% -40%，甚至造成绝收，严重制约设施农业的可持续发展。目前生产上防治设施蔬菜土 传病害主要采取"化学农药处理土壤+夏季闷棚"的措施，所使用的化学药剂有：福尔马林、 多菌灵、敌克松等，在土壤中大量使用化学药剂，可导致蔬菜品质下降，土壤有毒化学物质 超标，对人类健康带来严重危害，且该方法仍不能有效防控土传病害发生。因此开拓以生物 农药为核心的无公害综合防治设施蔬菜土传的技术体系，为无公害优质蔬菜的产业化生产 提供核心保障技术即为重要。
[0003] 中国专利ZL201210208366. 9公开了一株能够有效防控设施蔬菜土传病害的解淀 粉芽孢杆菌B1619,该菌株在YPGA培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为圆形，四周光滑， 乳白色；革兰氏染色阳性；细胞形状为杆状，细胞直径大于1ym，该B1619菌具有较广的抑 菌谱，对多种植物病原菌有很强的抑制作用；生长速度快，适应环境能力强，能在土壤和植 物表面定殖，并形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质；对设施蔬菜 枯萎病菌和根结线虫病均有较好的防控效果；并且对设施蔬菜的生长有一定的促生作用。
[0004] 解淀粉芽孢杆菌B1619防治设施蔬菜土传病害的主要作用机理是：营养与侵 染位点的竞争作用、分泌抗菌物质、诱导植物产生抗病性，因此解淀粉芽孢杆菌生防菌 B-1619生物发酵菌液中含菌量越高，在植物根围土壤中与病原菌之间营养与侵染位点竞 争能力强，分泌的抗菌物质越多，诱导抗病性作用越强，生物防治效果越好，该专利所提供 的生防菌液含菌量为K^cfu/ml，生防菌菌粉含菌量为4X109cfu/克（可湿性粉剂）；ZL 201410086984.X则公开了解淀粉芽孢杆菌B1619的水分散粒剂，其含菌量为5XK^cfu/ g-30X101Qcfu/g，该水分散粒剂是以ZL201210208366. 9中获得的发酵液为基础，经过浓缩 后制备，目前上述两个专利均没有涉及产业化生产中如何通过优化培养基成分和配比、发 酵条件来提高发酵液的含菌量的内容。
[0005]因此，为了确保解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂对设施蔬菜土传病害防治效 果，提高发酵液中含菌量，有必要通过科学、有效的方法对解淀粉芽孢杆菌B1619生物发酵 的培养基配比组合和培养条件组合进行优化。
[0006] 正交实验设计是研究多因素多水平之间的关系、寻求最优水平组合的一种设计方 法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点 具备了"均匀分散，齐整可比"的特点，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法，在众多领 域的研究中得到广泛应用，如郭杭等人用正交试验优化高浓度酒精发酵促进剂配方，有效 缩短了发酵时间，显著优于同类传统工艺方法；候银环等人用正交试验优化马齿苋提取物 制备工艺，获得的工艺条件降低了提取成本，制备工艺稳定可靠，简便易行；目前利用正交 试验法优化获得的以提高解淀粉芽孢杆菌生防菌株B-1619发酵菌液中活菌量为目的的发 酵培养基和培养条件，未见诸报道。
【发明内容】
[0007] 针对上述问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌B-1619的发酵培养方法，以提高 发酵液中菌含量，本发明是这样实现的：
[0008] -种解淀粉芽孢杆菌B1619的发酵培养方法，其特征在于，具体步骤如下：
[0009] 将解淀粉芽孢杆菌B1619菌液以装液量60ml/250ml接种至优化培养基，温 度28°C、转速180rpm条件下培养48h;所述优化培养基为：以质量百分数计，玉米淀粉 1. 20 %，CaC030. 15 %，0. 25 %的酵母膏，2. 0 %的大豆粉，0. 05 %的生长素，余量为H20,pH= 7. 00〇
[0010] 本发明在传统的发酵培养方法的基础上，采用正交试验法对发酵培养基配比组合 和培养条件组合进行优化，形成解淀粉芽孢杆菌B-1619专用发酵培养方法，提高解淀粉芽 孢杆菌生防菌株B-1619发酵液中含菌量，含菌量为7. 13X101(]芽孢/毫升，优化率高达 87. 63 %，为后续发酵液的进一步处理，制备高含菌量的可湿性粉剂、水分散粒剂奠定基础； 同时，专用发酵培养方法培养的B1619发酵液中的芽孢生长更加健壮，适宜加工制备成水 分散粒剂，其水分散粒剂的含菌量优化率为699. 02%。
【附图说明】
[0011] 图1为优化前芽孢生长示意图。
[0012] 图2为优化后芽孢生长示意图。
【具体实施方式】
[0013] 实施例中含菌量的检测方法（稀释平板法）：菌液lmL置于9mL无菌水中，制成10 2 稀释液，依次类推，制成10 6、10 7、10 8稀释液；在其中各吸取330yL，加到YPGA培养基平板 中，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3次；将上述平板，置于28°C恒温培养箱中培养2d，检 测平板上的菌落数，计算发酵菌液含菌量；
[0014] 初始培养基：以质量百分比计，玉米淀粉1. 20%，黄豆粉1. 50%，酵母膏0. 10%， CaC030. 15 %，鱼粉 0? 50 %，玉米浆 0? 50 %，余量为H20,pH= 7. 00 ;
[0015] YPG培养基：葡萄糖5克，胰蛋白胨5克，酵母膏5克，用水定容至lOOOmL，pH 7. 0 ;备用B1619菌液是使用实验室的YPG培养基28°C振荡培养48小时获得的，含菌量为 1010cfu/ml〇
[0016] 实施例1发酵培养基单因子水平筛选
[0017] 初始培养基是目前发酵常用培养基，本实施例在其基础上除去鱼粉，玉米浆，保持 其他成分含量不变，再分别改变酵母膏、大豆粉的含量和新加入的微量元素（氯化钠、维生 素B6、甘氨酸、胰蛋白胨、生长素），培养基pH调至7. 00,以筛选发酵培养因子。
[0018] 筛选步骤：取备用菌液1ml，移至装液量为60ml的250ml三角瓶中，将接种后的三 角瓶置于30°C、150rpm振荡培养，48h后计算活菌数，每个处理重复3次。发酵培养基单因 子筛选结果见表1 :
[0019]表1解淀粉芽孢杆菌B1619发酵培养基单因子水平筛选结果
[0020]
[0021] 表1中添加量均以质量百分比计，由表1培养结果可见，酵母膏添加量在质量百分 比为0. 25%、0. 50%、1. 00%时，大豆粉量在1. 00%、1. 50%、2. 00%时，在培养基中添加甘 氨酸、胰蛋白胨、生长素时，测得的活菌数相对较高，上述9个因子进入正交试验。
[0022] 实施例2发酵培养条件单因子水平筛选
[0023] 解淀粉芽孢杆菌B1619的初始培养条件（目前常用培养条件）：温度30°C、摇床转 速 150rpm、装液量 60ml/250ml。
[0024] 在初始培养条件的基础上，分别单一改变培养温度、摇床转速、装液量：取备用菌 液lml于装有初始培养基的250ml三角瓶中，48h后计算活菌数，每个处理重复3次，发酵条 件单因子筛选结果见表2:
[0025] 表2解淀粉芽孢杆菌B1619发酵条件单因子水平筛选结果
[0026]
[0027] 由表2可见，当温度为26 °C、28 °C、30 °C时，转速为180rpm、2lOrpm、240rpm时，装液 量为20ml/250ml、40ml/250ml、60ml/250ml时，测得的活菌数相对较高，上述9个因子进入 正交试验。
[0028] 实施例3发酵培养基正交试验优化结果
[0029] 在发酵培养基单因子水平筛选试验结果的基础上，严格按照L9 (33)正交表排列 组合，对筛选获得的酵母膏、大豆粉、微量元素3个水平进行3因素3水平正交试验。
[0030] 试验步骤：取备用菌液1ml移