一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 芽孢杆菌（Bacillusspp.)广泛存在于自然界的一种革兰氏阳性细菌。该菌通过 分泌抗生素、抗菌蛋白和多肽类等多种抗菌活性物质杀死植物病原物，减少后者对植物的 为害。芽孢杆菌易于繁殖，对不良环境具有很强的抵抗力，非常适合生物制剂的开发、储存 和应用，但同时也因其发酵液富含养分，储存不当容易污染，且要保证其具有活性。因此，与 化学农药相比，生物菌剂的剂型研制相对困难。
[0003] 解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens，BA)是目前农业部令（2008年 1126号）酶制剂类饲料添加剂所允许使用的益生菌种类，但该菌在农业部令动物微生物饲 料添加剂栏目中尚未列出。
[0004] 同时目前，芽孢杆菌菌剂主要有可湿性粉剂、乳剂、悬浮剂剂型，但不同的芽孢杆 菌菌株间产孢率、芽孢存活率以及对助剂的敏感性不同，针对特定的菌株，因此需要适合的 剂型非常重要。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] -种解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensGB1菌株于 2015年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号 为CGMCCNo. 11250。
[0008] 所述解淀粉芽孢杆菌特异性碱基序列为SEQIDNo. 2-15所示。
[0009] 所述解淀粉芽孢杆菌特异性碱基序列可作为检测解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensGB1 的标记物。
[0010] 一种检测解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensGB1的标记物，标记物为 SEQIDNo. 1-14序列中一个或几个序列。
[0011] -种解淀粉芽孢杆菌在防治病原真菌引起的病害中的应用。
[0012] -种解淀粉芽孢杆菌作为用于制备植物促生长调节剂中的应用
[0013] -种生物制剂，生物制剂中含所述的解淀粉芽孢杆菌GB1。
[0014] 所述生物制剂剂型为可分散液剂、水乳剂、水悬浮剂、乳油、微乳剂、水分散粒剂或 可湿性粉剂；所述剂型配制可按照现有技术记载的内容完成。
[0015] -种生物制剂在防治病原真菌引起的病害中的应用。
[0016] -种生物制剂作为用于制备植物促生长调节剂中的应用
[0017] 本发明所具有优点：
[0018] 本发明所获得的解淀粉芽孢杆菌GB1，分离自黄瓜老茎，该菌株具有的广谱抑菌作 用，其是，能够高效抑制病原真菌分生孢子萌发、菌丝生长，并定植于伤口形成生物膜，有效 阻止病原真菌对其的侵染，抑制植物病原菌以及其他有害微生物的侵染繁殖，并且具有促 进植物生长的机制，产生植物激素促进植物生长发育，进而增加产量。
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌GB1在LB培养基上的培养性状图。
[0020] 图2为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌GB1基因组DNA圈状图。
[0021] 图3为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌GB1对一些植物病原菌的平板抑制效 果图。其中，A:苹果树腐烂病菌；B:苹果斑点落叶病菌；C:苹果炭疽叶枯病菌；D:苹果轮纹 病菌；E:苹果炭疽病菌；F:葡萄炭疽病菌。
[0022] 图4为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌GB1抑制苹果树腐烂病菌生长发育图 片。其中，A1 :苹果树腐烂病菌正常菌丝，A2-A6 :GB1对苹果树腐烂病菌菌丝的裂解作用； B1:苹果树腐烂病菌孢子萌发正常，B2:苹果树腐烂病菌孢子受到GB1强烈抑制，不能萌发。
[0023]图5为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌GB1定殖于苹果树枝条伤口形成生物 膜图。其中，左图，GB1定殖于苹果树枝条木质部；右图，GB1定殖于苹果树枝条韧皮部，并 在伤口愈合处形成生物膜。
[0024]图6为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌GB1加速苹果树枝条伤口的愈合。其 中A为生防菌株GB1的发酵液涂抹的伤口愈合图，B为涂抹40%福美砷可湿性粉剂50倍液 的伤口愈合图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0026] 实施例1
[0027] 解淀粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensGB1菌株的筛选：
[0028] 材料：所采用的样品为黄瓜品种一一津杂3号的老茎。
[0029] 所用的培养基：LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g，调pH至7.0， 用去离子水定容至1L)。
[0030] 筛选过程：用无菌水冲洗黄瓜老茎，晾干后切成约1cm长的小段，浸泡于75%酒 精中2min，再用无菌生理盐水（0.9%NaCl)彻底清洗组织（小段）3次，将组织转移到 无菌的研钵中磨碎后转移到装有15mL离心管中，水浴（80°C) 10分钟。将管中的浆液梯 度稀释后，取100μL的培养液涂布于LB平板上，37°C培养箱中培养24h，选取平板上菌 落形态不同的单个菌落。经平板对持试验，抑菌效果最好的为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensGB1 菌株。
[0031] 所述解淀粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensGB1，该菌株于2015年8月 18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 11250,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编 100101。
[0032] 菌落形态特征：菌株GB1菌体呈短杆状，具运动性，兼性厌氧，染色均匀，可形成内 生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性。在LB培养基上呈 白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则（参见图1)。
[0033] 培养条件对菌株生长的影响：GB1在LB培养基中生长较快，温度为15~45°C间都 能生长，但在30~40°C时最适于生长，pH5~9,足够的通气条件有利于菌体繁殖，当培养 基的pH值低于4或高于10时，则生长缓慢。
[0034]鉴定：16SrDNA序列，DNA旋转酶A亚基基因（gyrasesubunitA)，（gyrA)序列 和组氨酸合成酶（cheA)基因序列，及基因组序列用于GB1种类的鉴定。GB1的16SrDNA， GyrA和CheA基因序列（GenBank登记号分别为KP337613,KP337615和KP337614)显示，与 解淀粉芽孢杆菌相似度达99%以上。基因组DNA的聚类结果表明，其与解淀粉芽孢杆菌聚 在一支（clade)〇
[0035] 同时，通过IlluminaHiseq2000平台测序，样品GB1共产出679Mb数据。基于测 序数据组装得到样品GB1基因组大小为4, 014, 477bp，GC含量46. 43%，共4个scaffold， 6个contig。基因组组分分析后发现，样品GB1的基因组含有4, 011个基因，总长度为 3, 572, 685bp，平均长度891bp，占基因组全长的89. 00%。串联重复序列共139个，总长为 9, 058bp，占基因组全长的0.2256%。小卫星序列114个，微卫星序列7个。tRNA85个， rRNA27个（参见图2)。
[0036] 并且，通过相应的同源性比对，本发明解淀粉芽孢杆菌GB1具有14个特异性基因 核苷酸序列，分别如SEQIDNo. 1-14所示：
[0037]SEQIDNo. 1--GB1_00345
[0038]ATGATCATTAAAATGACTCCATTTAATATGAAAGAATTCAATAAACCAAACAACCATTTGCTGTTTCAG GGAGAATTGCACCTGCATTTGAAAACAATGTGTGGAATATACCGAGGAACGATTTGCTGA
[0039]SEQIDNo. 2--GB1_00389
[0040]ATGAAGATCAGCCGGACTTTGTTTTCAGTCATTTTATTGGGTAGCATCGCAGGAGTAATTTTAACAAAT GATGCCCCTGTTATCAAAGCTCCTTTCCATGTTGCTGACGACAGAGTAGGTGCTTAG
[0041]SEQIDNo. 3--GB1_02087
[0042]ATGTGGATGATCATTTTGCTGCTTATCATTTTAATCGGTTTTACCGGTAATATCATCTCGCTTTTGAGA GCGCAAAGACACGCATCTCAAAGAATAATTGAGCTTTTAGAAAAGCAAAGCCGAAAATAA
[0043]SEQIDNo. 4 --GB1_02122
[0044]ATGCGCAAAGAACAAGACCGTTACATCTATGATGAAAAAGAAAGTGAAGAAACGGCCAGGCTCATCTCA GAGGCATACGAAAGCGGTTATGTCGGCATGGAGGAAGCCTCTGCTCCTTCAGAAAATTAA
[0045]SEQIDNo. 5--GB1_02233
[0046]GTGGACAACAAAGAATTTGGATACGTTAGTGTAAGTAGCAAAGACCAAAATGAAGCACGACAACTGG ATAGTATGTATGCTCTTGGAATTGATGAGCGTGATATTCATATCGATAACAAAGCGGGAAAGACTTCAATAGACC TCAATACCAAGCTTTGA
[0047]SEQIDNo. 6--GB1_02325
[0048