一株同温层芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物根际促生菌及其应用技术领域，具体涉及一株促进烟草生长的具 有降解蛋白质和解磷，以及产细胞分裂素功能的同温层芽孢杆菌及其促生特性的应用。
【背景技术】
[0002] 烟草是前科（Solanaceae)烟草属（Nicotiana) -年生草本植物。喜温、喜光、耐 旱、怕涝、耐瘠、需钾较多。烟草叶、茎、花萼和果都有多细胞的毛，其中腺毛细胞中含有叶绿 素，能综合含有树胶和树脂的渗出物，与烟草的香气有一定关系。烟草叶柄不明显或成翅状 柄，其圆锥花序顶生，花萼筒状，花冠漏斗状，末端粉红色。蒴果，种子黄褐色。烟草原产于南 美洲，因其叶片含烟碱（尼古丁），采收后经过调制、分级和加工处理，可制卷烟、雪茄烟、旱 烟等，是烟草工业重要的原料。近年来我国烟田施肥出现很大的问题，具体表现为：（1)肥 料利用率不高，有资料表明我国烤烟肥料利用率较低，南方一些省份肥料利用率仅20%左 右。其原因是对肥料利用率的相关性技术缺乏深入研究，特别是对南方烟区肥料流失的控 制和北方烟区的营养吸收障碍等没有从根本上研究解决；(2)烟田土壤肥力不同程度出现 下降趋势，由于缺乏良好的培肥地力措施，加之轮作条件差，烟田常年连作，土壤主要营养 元素都不同程度出现下降趋势，同时土壤物理性状变劣；（3)营养不平衡，重氮轻磷缺钾； (4)对旱作烟草的施肥技术缺乏研究。
[0003] 研究发现植物根际土壤中含有一些可以促进植物生长的微生物，一般有固氮、解 磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力的细菌、蓝细菌等。 统称为植物根际促生菌（PGPR)，其促生作用机制主要有以下几大类：提供植物营养物质、 产生植物生长调节物质、植物根际生物修复剂和环境胁迫调节剂等。但筛选出具有多种功 能且高效的微生物菌株一直是本领域追寻的目标。
[0004] 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，蛋白酶种类的多样性和水解活性的专一性， 使其在食品、皮革、洗涤剂等工业生产领域成为具有重要商业价值的工业酶。土壤中含有大 量蛋白质，可以利用PGPR产蛋白酶将土壤中的蛋白质分解，产生可以供给烟草使用的氮， 为烟草田提供大量的氮源，这样就可以减少化肥的使用，避免了对土壤及环境的破坏。但目 前还未见同时具有高效降解蛋白质和解磷，以及产细胞分裂素功能的同温层芽孢杆菌及其 促进烟草生长的应用报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株同温层芽孢杆菌及其促进烟草生长的应用，该菌株具有 降解蛋白质和解磷，以及产细胞分裂素功能。
[0006] 一株同温层芽孢杆菌（Bacillusstratosphericus)PRl，该菌株保藏编号：CGMCC No.9612〇
[0007] 所述的同温层芽孢杆菌的培养条件，采用的LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g， NaCllOg，蒸馏水 1000ml，121°C灭菌 20min，培养温度 37°C，pH7. 0。
[0008] 所述的同温层芽孢杆菌的应用，用于降解蛋白质和/或解磷和/或产细胞分裂素， 从而促进植物的生长。所述的的植物包括烟草。
[0009] 本发明菌株培养后得到菌悬液作为液态菌剂使用，菌悬液的菌数浓度cfu多10s 个/mL。菌剂的使用方法：缓苗后灌根，每株烟苗加菌剂lmL。
[0010] 本发明菌株的菌落及菌体特征为：该菌株在LB培养基（蛋白胨10g，酵母浸膏5g， NaCllOg，蒸馈水1000ml，121°C灭菌20min，温度37°C，pH7.0。）上培养48h后菌落呈圆 形，半透明，表面光滑，淡黄色，边缘整齐，菌落稍凸起。菌体呈杆状，产芽孢，革兰氏染色阳 性。
[0011] 该菌株的生理生化特征为：甲基红试验阴性、v-ρ试验阴性、淀粉水解试验阴性、 硝酸盐还原试验阳性、吲哚试验阴性、硫化氢试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、葡萄糖发 酵试验阳性、蔗糖发酵试验阳性、麦芽糖发酵试验阳性、乳糖发酵试验阴性、甘露醇发酵试 验阴性、葡萄糖碳源利用试验阳性、乳糖碳源利用试验阳性、甘露醇碳源利用试验阳性、蔗 糖碳源利用试验阳性、麦芽糖碳源利用试验阳性、柠檬酸碳源利用试验阴性、2 %NaCl耐盐 试验阳性、5 %NaCl耐盐试验阳性、7 %NaCl耐盐试验阳性、10 %NaCl耐盐试验阳性、产氨 试验阳性。
[0012] 该菌株的最适培养条件为：LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水 1000ml，温度 37 °C，pH7. 0。
[0013] 该菌株可以用于制备微生物菌剂；应用时用LB培养基培养得菌悬液（菌悬液的菌 数浓度cfu多10s个/mL)，作为液态菌剂。
[0014] 菌剂的使用方法：缓苗后灌根，每株烟苗加lmL。
[0015] 经研究表明，对本发明的菌株的功能测定结果如下：在脱脂奶粉的培养基（脱脂 奶粉 3. 0g，琼脂 3. 0g，去离子水 200mL，ρΗ7· 0 ~7. 2,108°C灭菌 20min。）中培养 24h(37°C) 后测得其菌落半径为〇.lcm，透明圈半径为0. 9cm，透明圈与菌落半径之比为9 ;用国标法 以酪蛋白为底物测得PR1的蛋白酶酶活为7.493IU。在蒙金娜固体培养基（葡萄糖10g， (NH4)2S04 0 . 5g，NaCl0.3g，MgS04.7H20 0.3g，FeS04 0 . 03g，MnS04.H20 0.03g，CaC03 5.0g， KC1 0· 3g，Ca3 (P04) 225. 0g，卵磷脂 0· 3g，琼脂 18 ~20g，pH值 7. 2 ~7. 4。）上培养一周 后，测得第一天其菌落直径d为1. 5mm，溶磷圈直径D为5mm，D/d为3. 3,第三天其菌落直径 d为2. 5mm，溶磷圈直径D为8. 5mm，D/d为3. 4,第七天其菌落直径d为3. 5mm，溶磷圈直径 D为 13mm，D/d为 3. 7 ;在无机磷液体培养基（葡萄糖 10. 0g，（NH4)2S04 0· 5g，NaCl0· 3g， KC1 0· 3g，MgS04 · 7H20 0· 3g，FeS04 · 7H20 0· 03g，MnS04 · 4H20 0· 03g，Ca3(P04)225. 0g，水 1000mL，pH7. 0-7. 5。）培养4天后，用钼蓝比色法测定培养液中速效磷的含量变化，从而反 应细菌的解磷能力，测得PR1培养液中速效磷含量为43. 3mg/L。在放有小麦真叶的PR1的 菌悬液中25°C暗室放置4d后目测叶片保绿效果，发现经PR1处理过的叶片依然是绿色，说 明PR1有很好的保绿作用，可以产生细胞分裂素。盆栽30天时经PR1处理的烟株叶片数略 小于对照，而最大叶片表面积大于对照，但是没有达到显著差异，60天时经PR1处理的烟株 茎围、最大叶片表面积、叶片数均高于对照，而株高略低于对照，茎围比对照达到显著差异， 90天时经PR1处理的烟株株高、叶片数与对照相比达到显著差异，经PR1处理的烟草植株的 根、茎、叶、植株总鲜重均好于对照处理，且均达到显著差异，在采收后对生物量的统计中可 以看出植株的根、茎、叶干重以及植株总干重均要优于对照，同时根干重、茎干重、植株总干 重均在达到显著差异。与对照相比，根干重增幅为62. 2%，茎干重增幅为49. 22 %，叶总干 重增幅为13. 97%，植株干重增幅为26. 26%。以上研究结果表明，PR1菌株可以很好的促 进烟草生长，在促进烟草生长方面具有潜在的应用价值。
[0016] 本发明同温层芽孢杆菌（Bacillusstratosphericus)PRl。保藏单位：中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCCNo. 9612。
【附图说明】
[0017] 图1为60天和90天PR1处理与对照的烟株株高柱形图；
[0018] 图2为60天和90天PR1处理与对照的烟株茎围柱形图；
[0019] 图3为30天、60天和90天PR1处理与对照的烟株最大叶表面积柱形图；
[0020] 图4为30天、60天和90天PR1处理与对照的烟株叶片数柱形图；
[0021] 图5为PR1处理与对照的烟株鲜生物量柱形图；
[0022] 图6为PR1处理与对照的烟株干生物量柱形图；
[0023] 图7PR1降解蛋白质效果图；
[0024] 图8PR1解磷效果图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0026] 本发明同温层芽孢杆菌（Bacillusstratosphericus)PRl，保藏单位：中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCCNo. 9612。
[0027] (1)CGMCCNo. 9612 的筛选
[0028] 在牛肉膏蛋白胨液体培养基富集的过程：取采集自湖南桑植官地坪、浏阳烟科所 的烟草根际土壤，共10个样品，编号为Gl、G2、G3、G4、G5、Ll、L2、L3、L4、L5,每个土样称取 10g，加入100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，191r/min、37°C摇床振荡培养24h。
[0029] 以脱脂奶粉为底物降解蛋白质的过程：取富集后的培养液经梯度稀释后，从10 \ 10 2、10 3、10 4稀释度中吸取100μL稀释液涂布于高氏一号培养基上，在28°C条件下培养 3天；从10 3、10 4、10 5、10 6稀释度中吸取100μL涂布在PDA培养基上，37°C条件下培养1 天；从10 5、10 6、10 7、10 8稀释度中吸取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，37°C条件下 培养1天。
[0030] 待涂布的平板上长出菌后用灭菌牙签将菌落挑到脱脂奶粉培养基上。观察选取能 够产生明显透明水解圈的细菌分离物，如此反复验证多次之后，挑取能稳定产生透明圈的 菌株进行反复纯化，再在脱脂奶粉培养基上每个平板点种4株菌株，37°C恒温培养，72h后 测量不同菌株的透明圈和菌落直径。根据透明圈与菌落半径比（HC)值的大小，筛选产蛋白 酶能力相对较强的菌株。将纯化后的菌落接种至LB固体斜面培养基中（蛋白胨10g，酵母 浸膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121°C灭菌20min，温度30°C，pH7.0。）保存。共得到 144株可以降解蛋白质的菌株。
[0031] 通过平板透明圈法，国标蛋白酶测定法，紫外分光光度法（测生长素含量），保绿 法，解钾能力测定法，溶磷圈法和钼蓝比色法分别测定其降解蛋白质的能力，产生长素能 力，产细胞分裂素的能力，解钾能力和溶磷能力。从分离得到的菌株中筛选出一株既能降解 蛋白质又可以解磷又能产细胞分裂素的菌株，记为PR1。
[0032] (2)CGMCCNo.