一种纳豆菌及其选育方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的选育，特别涉及一种纳豆菌及其选育方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 纳豆菌产自纳豆，纳豆是日本人把煮熟的大豆用稻草包起来、在40°C的温度下发 酵而成的一种食品。纳豆菌的发酵产物中含有纳豆激酶，是一种能够溶解血栓的酵素，并且 无毒副作用，纳豆激酶是一种理想的治疗和预防血栓的潜在药物，只是，纳豆菌发酵产生的 纳豆激酶产量低，酶不稳定容易失活，限制了其发展应用，但是，作为纳豆菌发酵的食品和 饮料，长期使用，则有一定的预防和保健效果。
[0003]目前，采用传统的纳豆菌菌种发酵的食品不仅纳豆激酶的含量不高，其口味也不 佳，有很重的发酵涩味和酸味，还具有粘丝，影响人们食用的口感，采用与其他食物相伴的 方法，也不能完全去除口味。加热的方法虽然能去除口味，但是，纳豆发酵食品中含有的纳 豆激酶等活性酵素成分会失去活性，起不到保健的效果。
【发明内容】
[0004] 本发明针对目前的纳豆菌发酵食品中纳豆激酶及其他有益酵素的含量低，口味差 等因素，提出一种纳豆菌及其选育方法和应用。
[0005] 一种纳豆菌，为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCCNo. 11274。
[0006] 所述枯草芽孢杆菌拉丁文全称为：Bacillussubtilis。保存于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 所述纳豆菌在制备富含纳豆激酶的发酵食品或发酵饮料中的应用。
[0008] 利用上述纳豆菌发酵生产富含纳豆激酶的食品的方法，按照如下步骤进行：
[0009] (1)将所述的枯草芽孢杆菌菌株QR经平板培养基活化，种子摇瓶培养，一级摇瓶 培养或发酵罐逐级扩大培养，得到种子液；
[0010] (2)将植物的种子蒸熟或者煮熟，降温至室温；
[0011] (3)按照重量份数，取蒸熟或者煮熟的种子100份，加入葡萄糖1-3份，氯化钠 0. 01-0. 5份，肉粉1-5份，水20-60份，搅拌均匀，制成基料，接入上述枯草芽孢杆菌的种子 液，在34-38°C条件下发酵16-35小时；
[0012] (4)将上述制备好的发酵种子在4°C条件下，后熟4-32小时，制成。
[0013] 所述植物的种子为大豆，大米，小米，薏米，红豆，绿豆，花生，豇豆，高粱，蔬菜，芹 菜，玉米中的一种或一种以上。
[0014] 所述步骤（3)枯草芽孢杆菌的种子液的接入量为：lKg基料中接入100mL菌液浓 度为l-8X10scfu/mL的种子液。
[0015] -种利用上述纳豆菌发酵生产富含纳豆激酶的饮料的方法，按照如下步骤进行：
[0016] (1)将所述的枯草芽孢杆菌菌株QR经平板培养基活化，种子摇瓶培养，一级摇瓶 培养或发酵罐逐级扩大培养，得到种子液；
[0017] (2)取植物原料打浆制备发酵原液；
[0018] (3)向发酵原液中加入枯草芽孢杆菌种子液，接入量为发酵原液体积的6-8%， 34-40°C条件下发酵2-3个月；
[0019] (4)发酵液置于10-15°c后熟4-5个月，收集表层上清液，制成。
[0020] 步骤（3)所述枯草芽孢杆菌种子液的浓度为l-8X10scfu/mL。
[0021] 所述植物原料为胡萝卜，樱桃，沙棘果，香蕉，苹果，芒果，西红柿，南瓜，梨，桃中的 一种或一种以上。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明筛选到的纳豆菌，应用于食品 发酵，生产丰富的纳豆激酶，多肽和其他对人体有益的功能性因子。该纳豆菌耐热性能好， 容易培养，发酵周期短，不容易失活，是一株优良的产纳豆激酶工程菌。
【附图说明】
[0023]图1为本发明纳豆菌采用NA培养基在37°C条件下培养1天的菌落图。
[0024]图2为本发明纳豆菌采用NA培养基在37°C条件下培养1天的电镜图。
[0025]图3为本发明纳菌的系统发育树图。
【具体实施方式】
[0026] 下面对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不 受【具体实施方式】的限制。
[0027] 实施例1纳豆菌的筛选
[0028] 一种枯草芽孢杆菌QR，其筛选过程如下：
[0029] (1)取东北地区自然发酵的黄豆酱20份，每份各取lg置于100mL已灭菌的三角 瓶中，加无菌生理盐水稀释12倍，振荡30s，于37°C，200r/min的条件下培养20小时，将菌 悬液置于80-85°C的水浴锅中加热lOmin，冷却后的菌悬液分别做梯度稀释，各取0.lmL涂 布于培养基平板（配方是：牛肉膏0.5%，蛋白胨0. 1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，余量为去 离子水）上，37°C倒置培养24h，挑取水解圈与菌落直径比值较大的菌落进行革兰氏染色及 镜检，选取镜检芽孢状，尺寸为（0.7-0. 8)μmX(2. 0-3.0)μm，成对成短链状排列的菌落，接 种到平板上进行划线分离纯化，将获得的单一菌株接种到LB斜面培养家上，37°C培养24小 时，于4°C冰箱保存备用。经过初筛，筛选到16株疑似产纳豆激酶高活性的菌株。
[0030] (2)参照Astrup等方法制备标准纤维蛋白平板，1小时候用尿激酶标准品点样10、 20、40、80、160、320IU/mL，37°C培养，18小时后测溶解圈垂直直径，以垂直直径乘积为横坐 标，酶活为纵坐标，在双对数坐标纸上绘制标准曲线。将待测样品分别点样于纤维蛋白板 上，培养18小时，测溶解圈垂直直径并在标准曲线上查出酶活。筛选出4株具有较高酶活 性的菌株，如表1所示。筛选出酶活性值最高的QR，进一步分离纯化，得到一株纯菌株。菌 株的鉴定如下：
[0031] (1)菌落形态
[0032] 如图1-2所示，直径0. 3-0. 8mm，乳白色，圆形，不透明，表面光泽，湿润，容易从培 养基上挑起，没有基内菌丝，挑起时有丝状物，边缘整齐。显微镜镜检呈芽孢状，成对成短链 状排列。在摇瓶液体培养基中培养48小时后，菌丝生长均匀，着色深，粗壮，生长较为整齐。 在静止液体培养基接种8天菌丝生长均匀，较细，色浅，有少量芽孢，后期自溶。
[0033]表1
[0034]
[0035] (2)生理生化特性
[0036]与《伯氏手册》中有关枯草芽孢杆菌的描述相比较，结论见表2,其与枯草芽孢杆菌 的理化性质一致。
[0037]表2
[0038]
[0040] (3) 16SrDNA鉴定
[0041] 采用北京百泰克生物技术有限公司生产的细菌DNA提取试剂盒提取纳豆菌的基 因组DNA，采用本领域通常的PCR引物进行16SrDNA基因的扩增，扩增的序列如序列表SEQ IDN0 :1所示；通过MEGA4. 1软件进行系统进化树的构建，结果得到了如图3所示的系统发 育树状图。系统发育学分析结果表明，QR菌株与Bacillustequilensis属菌株在同一分 支，结合前面的形态学和生理生化鉴定结果，初步鉴定QR为枯草芽孢杆菌属。该菌株已于 2015年8月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.11274。
[0042] 实施例2
[0043] 利用实施例1所述的纳豆菌发酵生产富含纳豆激酶的食品的方法，按照如下步骤 进行：
[0044] (1)将所述的枯草芽孢杆菌菌株QR经平板培养基活化，种子摇瓶培养，一级摇瓶 培养或发酵罐逐级扩大培养，得到种子液；