墨西哥微小杆菌2a及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于利用微生物及其代谢产物提高原油采收率的三次采油技术领域，具体 涉及墨西哥微小杆菌2a及其应用。
【背景技术】
[0002] 石油是工业经济的血液，石油安全关系到一个国家经济、社会的可持续发展与国 防安全。在经济全球化和区域化发展的国际环境里，世界各国均把石油资源的持续、合理及 稳定获得作为国家的重要战略。
[0003] 目前，通过一次及二次采油，原油采收率约为地质储量的30%左右，尚有大量的残 留原油有待通过新技术进行开采。限制原油采收率提高的主要因素:一是原油中的沥青、胶 质、蜡质等高分子烃粘度大，流动性差，二是原油紧密附着在储油层的多孔载体上不易流 动。此外，我国原油含蜡量非常高，随着原油的开采，石蜡从地层深处向表层流动时，其随温 度降低而凝结沉积在井壁及油管壁上，堵塞影响原油生产及运输。因此解除结蜡是原油生 产及管道运输亟待解决的问题。
[0004] 国内外常用机械清蜡、热力清防蜡及化学清蜡等。机械清蜡适用范围小，操作难度 大，且设备磨损严重，使用较少;热力清蜡投入大，维护费用高，效果并不理想;化学清蜡应 用较为普遍，操作简单、费用较低，但化学清蜡剂存在有毒、易燃及腐蚀设备等严重问题，对 人体健康和环境保护都十分不利。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株墨西哥微小杆菌2a及其 应用，可用于对原油或石蜡的降解、防止石蜡结晶沉积，进而提升原油的采收率。
[0006] ( - )一株墨西哥微小杆菌2a，分离自安塞油田、志丹油田的原油及油污土壤中，于 2014年12月28日保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Μ 2014674,命名为墨西哥微小杆菌2a(Exiguobacterium mexicanum 2a) 〇
[0007] 通过PCR反应，从细菌菌株2a的16S rDNA中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR产物 纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列 进行对比分析，该细菌菌株与Exiguobacterium mexicanum AM072764的16S rDNA序列同源 性达到99.78%，确认该菌株为墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum) 〇
[0008] 将墨西哥微小杆菌2a在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌株2a菌落大而干燥，橙色， 表面褶皱向上隆起，边缘不整齐;电镜下细胞呈长杆状，宽0.3~0.5μπι，长1.0~2. Ομπι。革兰 氏染色呈阳性，需氧，葡萄糖与蔗糖发酵为阳性，柠檬酸与丙二酸利用为阳性，乙醇氧化及 甲基红试验呈阳性，V-P试验为阴性，硝酸盐还原试验、亚硝酸还原及反硝化试验均为阳性， 脲酶试验为阴性，产氨气，能水解淀粉与明胶。
[0009] (二)墨西哥微小杆菌2a的应用
[0010] (1)在原油降解中的应用。
[0011] (2)在固体石蜡降解中的应用。
[0012] (3)在防止石蜡结晶沉积中的应用。
[0013] (4)在饱和烃降解中的应用。
[0014] (5)在芳香烃降解中的应用。
[0015] (6)在胶质降解中的应用。
[0016] (7)在沥青降解中的应用。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0018] (1)本发明的墨西哥微小杆菌2a对原油及固体石蜡的降解能力强，能够降低原油 黏度，增加石蜡在正己烷中的溶解性，同时具有强烈的清蜡功能。
[0019] (2)本发明的墨西哥微小杆菌2a呈高疏水性及强烈亲脂性，有利于细菌附着于烃 类表面完成对烃类的降解。
[0020] (3)本发明的墨西哥微小杆菌2a细胞可较牢固地附着在金属表面，并生长繁殖，形 成由微生物细胞组成的具有很强的抗流体冲刷能力的细胞屏障，可阻止蜡质在载体表面结 晶沉积，具有很强的微生物防蜡功能。
[0021] 以上墨西哥微小杆菌2a对原油及石蜡的降解功能、其细菌细胞的疏水亲脂功能及 在钢材载体表面附着生长产生的防蜡功能在申请日前的文献中均无报道，因此该墨西哥微 小杆菌2a是一株新发现的多功能驱油细菌，对我国含蜡原油生产及管道运输结蜡难题解 决均具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0022] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0023]图1为墨西哥微小杆菌2a的菌落形态及显微形态图。
[0024]图2为墨西哥微小杆菌2a的系统进化树图。
[0025]图3为墨西哥微小杆菌2a处理固体石蜡在正己烷中的溶解效果对比图。其中，图左 为空白组效果图，图右为墨西哥微小杆菌2a对固体石蜡溶解性的效果图。
[0026]图4为墨西哥微小杆菌2a发酵液处理固体石蜡扫描电镜图。其中，图左为空白组处 理固体石蜡扫描电镜图，图右为墨西哥微小杆菌2a发酵液处理固体石蜡扫描电镜图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但是以下实施例并不作为限制 本发明的保护范围。
[0028]实施例1菌种的鉴定 [0029] (1)形态特征
[0030]将墨西哥微小杆菌2a在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌株2a菌落大而干燥，橙色， 表面褶皱向上隆起，边缘不整齐;电镜下细胞呈长杆状，宽0.3~0.5μL?，长1.0~2. Ομπι。具体 形态如图1。
[0031 ] (2)生化特性
[0032]革兰氏染色呈阳性，需氧，葡萄糖与蔗糖发酵为阳性，柠檬酸与丙二酸利用为阳 性，乙醇氧化及甲基红试验呈阳性，V-P试验为阴性，硝酸盐还原试验、亚硝酸还原及反硝化 试验均为阳性，脲酶试验为阴性，产氨气，能水解淀粉与明胶。
[0033] (3)16S rDNA序列分析
[0034] 通过PCR反应，从细菌菌株2a的16S rDNA中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR产物 纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列 进行对比分析，该细菌菌株与Exiguobacterium mexicanum AM072764的16S rDNA序列同源 性达到99.78%，确认该菌株为墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)。墨西哥微 小杆菌2a的系统进化树如图2。
[0035] 16S rDNA扩增测序结果如SEQ ID No.l所示，如下：
[0036] GTCGAGCGCAGGAAATCGACGGAACCCTTCGGGGGGAAGTCGACGGAATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAA AGAACCTGCCCTCAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCGGGGCTAATACCGGATGGGTCATCGGACCGCATGGTCCG AGGATGAAAGGCGCTTCGGCGTCGCCTGGGGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCA AGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGCCTTCGGGTC GTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCAGGCAATGGCGGCACCTTGACGGTACCTTGCGAGAAAGCCAC GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCG CAGGCGGCCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGCCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTA TAGGAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAC TCTTTGGCCTATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGAAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGG AGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA GCAACGCGAAGAACCTTACCAACTCTTGACATCCCCCTGACCGGTACAGAGATGTACTTTCCCCTTCGGGGGCAGGG GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TCCTTAGTTGCCACCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC AAATCATCATGCCCCTTATGAGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGT GGAGCCAATCCCAGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTA ATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA CACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTAGGGAGCC
[0037]实施例2菌种的应用
[0038] (1)对原油的降解
[0039]试验方法:将墨西哥微小杆菌2a活化并接入到装有250mL灭菌原油降解培养基的 600mL组培瓶中，30°C静置培养14d，以不接墨西哥微小杆菌2a的原油降解培养基为空白对 照。培养期间每天摇晃组培瓶，使培养体系内菌体与基质保持均匀。培养结束后，通过氧化 铝柱层析吸附色谱法测定菌株对原油中饱和烃、芳香烃、胶质以及沥青质含量变化。
[0040] 试验结果:如表1所示，由表可知，墨西哥微小杆菌2a对原油中饱和烃、芳香烃、胶 质及沥青质的降解率分别为57.8%、73.1 %、72.8%及57.9 %，细菌