专利名称：一种生产l-乳酸的方法及其专用金橙黄微小杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产L-乳酸的方法及其专用金橙黄微小杆菌。
背景技术：
乳酸(Lactic Acid)又名ニ羟基丙酸，是世界三大有机酸之一。作为ー种传统的多用途精细化学品，乳酸可作为酸味剂、芳香剤、防腐剤、植物生长调节剂、生物可降解性材料、药物和农药等，应用于食品、制药、酿造、制革、纺织、环保和农业中。微生物发酵法生产乳酸，生产成本低，产品安全性高，而且能专ー性的得到光学纯乳酸，是大规模生产乳酸的主要方法。乳酸发酵过程中，由于不断生产产物而使发酵液的酸度逐渐上升，导致菌体生长和产酸都受到严重的抑制，为此要加入碳酸钙等中和剂进行中和。在乳酸的提取和纯化过程中，要加入硫酸对乳酸钙进行酸化，从而生成乳酸和不溶性的硫酸钙。碳酸钙作为中和剂的发酵エ艺增加了分离提取的成本，造成严重的环境问题。如果能采用氢氧化钠作为中和 齐U，可以避免下游纯化处理生成的硫酸钙残渣，有利于降低环境污染。由于钠离子对菌株的毒性，目前国内外利用氢氧化钠作为中和剂进行的L-乳酸发酵都未能达到理想的效果。嗜盐碱微生物是ー类在pH 9. 0以上也能生长的微生物类群。嗜盐碱菌对盐环境尤其是一价盐离子环境具有很好的耐受性，一般能够耐受10%以上的NaCl。这样的生理优势使其可以使用氢氧化钠代替碳酸钙作为中和剂来维持乳酸发酵过程中的PH，从而避免后续乳酸纯化过程中产生的不溶性钙盐。杨大伟等人2010年报道了筛选获得一株金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) LP3-3,在最佳发酵条件下L-乳酸产量为仅为16.27g/L。L-乳酸的生产成本是制约L-乳酸应用的关键因素之一。寻找能够低成本清洁生产高浓度L-乳酸的技术成为研究的热点。因此，获得能够适用于氢氧化钠调酸エ艺条件下，产高浓度L-乳酸的菌株具有重要的实际エ业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一株金橙黄微小杆菌及其在生产L-乳酸中的应用。本发明所提供的金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)具体为金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1,是从内蒙古鄂尔多斯盐碱湖湖边取得的水样中筛选得到的。该金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1已于2012年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 6154。金澄黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 在营养琼脂上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散，幼龄培养物为杆菌，老龄培养物为球状。革兰氏阳性。不生孢，不抗酸。以周生鞭毛运动。兼性厌氧。嗜碱，能在PH 6. 5 11. 5生长。耐盐，能在0-14%的NaCl条件下生长，10%的NaCl条件下不明显抑制产酸。从葡萄糖、蔗糖、半乳糖和ー些其他糖产酸。接触酶阳性，氧化酶阴性。还原硝酸盐。水解明胶、淀粉和酪素。其16s rDNA序列如序列表中序列I所示。
本发明的再ー个目的是提供ー种菌剂。本发明所提供的菌剂的活性成分为所述金橙黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8—11—1CGMCC No. 6154。本发明的另ー个目的是提供一种生产L-乳酸的方法。本发明所提供的生产L-乳酸的方法是发酵培养所述金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154,或以其为 活性成分的所述菌剂，得到L-乳酸。在上述方法中，所述发酵培养的pH可为7. 5-10. 5，如7. 5-9. 5，或8. 5-9. 5。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的PH具体为8. 5。在上述方法中，调节所述发酵培养的pH的中和剂可为NaOH水溶液。所述NaOH水溶液具体为浓度10-20M的NaOH水溶液。在本发明的一个实施例中，所述NaOH水溶液的浓度具体为15M。在上述方法中，所述发酵培养的培养基中含有碳源和氮源；所述碳源为终浓度可为20克/升-150克/升的葡萄糖，如20-120克/升、20-80克/升、80-120克/升、或80克/升，在本发明的一个实施例中，具体为100克/升；所述氮源为终浓度为5克/升-50克/升(如5-20克/升)的酵母粉(如安琪酵母粉)，在本发明的一个实施例中，具体为20克/升。在上述方法中，所述发酵培养的培养基中还可含有终浓度大于0克/升小于等于0. 4克/升(如0. 2-0. 35克/升或0. 35克/升)的MgSO4 7H20、终浓度大于0克/升小于等于4克/升(如1-2克/升或2克/升)的K2HPO4 *3H20、终浓度为大于0克/升小于等于5克/升(如I如克/升)的CH3C00Na、终浓度大于0克/升小于等于0. 06g克/升(如0. 03克 / 升)的 MnSO4 H2O。根据实际需要，所述发酵培养的培养基中还可含有NaCl、Na2C03、和/或聚蛋白胨。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的培养基的溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、K2HPO4 3H20、MgSO4 7H20、MnSO4 H2O, NaCl和Na2CO3 ;所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为80g/L，所述酵母粉在所述培养基中的终浓度为20g/L，所述K2HPO4 3H20在所述培养基中的终浓度为2g/L，所述MgSO4 7H20在所述培养基中的终浓度为0. 35g/L，所述MnSO4 H2O在所述培养基中的终浓度为0. 03g/L,所述NaCl在所述培养基中的终浓度为50g/L，所述Na2CO3在所述培养基中的终浓度为10g/L ;所述培养基的pH为8. 5。该培养基的制备过程中将其他溶质溶于溶剂水中高温灭菌后，再将高温灭菌的Na2CO3溶液加入其中。在上述方法中，所述发酵培养的温度可为30-42°C (如30-37°C或37_42°C)，在本发明的一个实施例中，具体为37°C;所述发酵培养的时间是12-72小时(如12-43h或12h或72h或26h)，在本发明的一个实施例中，具体为43h ;所述发酵培养的方式为旋转震荡培养，转速为40-60转/分钟(如50转/分钟)，旋转半径为30-40mm (如38mm)。本发明的又ー个目的是提供所述菌剂的制备方法。该方法可包括如下步骤将所述金橙黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154作为活性成分，得到所述菌剂。本发明利用金澄黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154生产L-乳酸，以葡萄糖为底物，在37°C条件下直接发酵生产L-乳酸，43小时内，L-乳酸浓度为133克/升，光学纯度大于99. 9%，转化率大于93%。本发明所提供的金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-ll_lCGMCC No. 6154可用氢氧化钠调酸,发酵生产高光学纯L-乳酸，有利于降低L-乳酸纯化成本，减少环境污染，具有重要的实际エ业应用价值。保藏说明菌种名称金橙黄微小杆菌拉丁名(Exiguobacteriumaurantiacum)菌株编号8_1トI保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年5月25日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 615
图 I 为金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154利用葡萄糖发酵生产L-乳酸的曲线。图中所示的乳酸即表示L-乳酸。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所涉及的各个參数的測定方法如下葡萄糖含量的測定发酵液离心后稀释，采用生物传感分析仪SBA-40C (山东省科学院生物研究所)測定。生物传感分析仪SBA-40C是以固定化酶为传感器的分析仪器，葡萄糖与氧气、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和双氧水。反应放出的双氧水与白金一银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度成线性比例关系，通过测定电流信号強度可得出葡萄糖浓度。L-乳酸含量的測定采用Agilent 1260液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)測定，有机酸柱(美国Bio-Rad公司，Aminex HPX-87H，ff(5um)4. 6IDX250_，有机酸分离用)，流动相为0. 005mol/L硫酸，流速0. 6ml/min,进样量5 u L，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度65°C。L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。L-乳酸光学纯度的测定采用Agilent 1260液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS I Off, 4. 6mm IDX 50mm，光学异构体分离用)。具体操作条件为2mM的硫酸铜作为流动相，流速0. 5ml/min,进样量10 U 1，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25°C。利用L-乳酸和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。光学纯度(optical purity)是衡量旋光性样品中一个对映体超过另ー个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中L-乳酸的光学纯度按以下公式计算(L-乳酸含量-D-乳酸含量)+ (L-乳酸含量+D-乳酸含量)X 100%。
糖酸转化率定义为L_乳酸产量(克/升)+总葡萄糖的消耗量(克/升)X 100%。下述实施例中所用到的酵母粉均购自安琪酵母股份有限公司；聚蛋白胨(polypeptone)购自日本制药株式会社，产品目录号394-00115。实施例I、金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1的分离筛选和鉴定本实施例中所用到的培养基组成如下筛选培养基(g/L):葡萄糖20. 0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10%(w/V) Na2CO3IOOml, pH 为 10. O。
固体培养基在筛选培养基的基础上添加15g/L的琼脂，pH为10. O。一、金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1 的分离筛选从内蒙古鄂尔多斯盐碱湖湖边取得水样。取4ml样品接种于装有50ml筛选培养基的IOOml三角瓶中，37°C活化培养3天，充分混匀后取样用无菌水稀释10，000倍涂布于固体培养基上，37°C培养一天，将长出的单菌落划线接种到新的固体培养基平板上，在37°C条件下静置培养24小吋，划线纯化后取单菌落接种到新的固体培养基平板上扩增培养，之后取菌接种到装有50ml筛选培养基的IOOml三角瓶中，12小时培养结束时，取发酵液，6，000转/分钟，离心半径为36mm，离心5分钟，取上清液。測定上清液中L-乳酸浓度和L-乳酸的光学纯度。得到一株L-乳酸产量和产率都较高、L-乳酸光学纯度接近100%的菌株。将该菌株命名为8-11-1。ニ、金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1 的鉴定从形态、生理生化特征和16s rDNA序列同源性几个方面对步骤ー获得的菌株8-11-1进行鉴定。其中，形态特征观察和生理生化特性鉴定參见“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等編著，北京科学出版社，2001. 2)中描述的方法。I、形态学鉴定经形态学鉴定，结果表明步骤一分离筛选得到的菌株8-11-1为革兰氏阳性菌，幼龄培养物为杆菌，老培养物为球状，I. l 1.2iimX1.4 3.2iim。不生孢，不抗酸。以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在营养琼脂上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散。嗜碱，能在PH6.5
11.5生长。耐盐，能够在0-14% (w/v)的NaCl浓度下生长。2、生理生化特征鉴定经生理生化特征鉴定，结果表明步骤一分离筛选得到的菌株8-11-1可利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和ー些其他糖产酸，主要产物是乳酸、こ酸和甲酸。接触酶阳性，氧化酶阴性。还原硝酸盐。水解明胶、淀粉和酪素。能够在30°C-45°C生长。3、16s rDNA序列同源性分析TE缓冲液10mmol/L的三轻甲基氨基甲烧(Tris)、lmmol/L的こニ胺四こ酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8. O。16s rDNA序列同源性分析的具体操作如下从固体培养的平板上取适量步骤一分离得到的菌株8-11-1加到50ul TE缓冲液中，95°C处理10分钟，处理液作为模板。
以上述处理液做为模板，利用购自上海生エ生物工程有限公司的真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增。所述的27f引物序列为:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ;所述1492r引物序列为5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。在50 yl反应体系依次混匀下列试剂35. 75 u I H2O, 5 U I的PCR反应缓冲液，4 u I dNTP混合液，2 的27f弓丨物，2 的1492r弓丨物，I U I模板，0.25 U I Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。将混合物在94°C加热5分钟。94°C变性I分钟，50°C退火I分钟，72°C延伸2分钟，总共30个循环。最后ー个循环后，于72°C下保温10分钟，使反应混合物扩增充分，得到菌株8-11-1的16S rRNA基因的PCR扩增产物，将产物测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)在线完成。测序结果表明，步骤ー获得的菌株8-11-1的16S rRNA基因序列长度为1465bp，如序列表中序列I所示。鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析結果，将步骤一分
离筛选得到的菌株8-11-1鉴定为金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)。该金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1已于2012年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 6154。实施例2、金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154利用葡萄糖为碳源发酵生产L-乳酸的最佳反应温度的測定(三角瓶)本实施例中所用的培养基的组成如下液体培养基(g/L):葡萄糖20.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10%(w/V) Na2CO3IOOml,培养基初始pH值为10.0。固体平板培养基在上述液体培养基中添加15克/升的琼脂。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(I)平板培养金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-lCGMCCNo. 6154菌种接种于固体平板培养基上，37°C培养24小时；(2)种子培养将步骤(I)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有50ml液体培养基的IOOml三角瓶中，37°C静置培养12小时，制得种子培养液；(3)发酵培养在装有50ml液体培养基的IOOml三角瓶中接入3ml步骤(2)的种子养液，分别放置于30°C、37°C、42°C、50°C和60°C静置培养26小时，结束发酵。发酵结束时，取发酵液，6，000转/分钟离心5分钟，取上清液，根据上述方法检测发酵液中生成的L-乳酸的浓度。实验重复进行三次。结果显示，30°C培养温度下，L-乳酸产量为11克/升；37°C培养温度下，L-乳酸产量为12克/升；42°C培养温度下，L-乳酸产量为11克/升；50°C培养温度下，L-乳酸产量为3克/升；60°C培养温度下，L-乳酸产量为0克/升。以上结果显示金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 利用葡萄糖的最佳发酵温度为37。。。实施例3、金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154在不同NaCl浓度条件下产酸情况(三角瓶)
本实施例中所用的培养基的组成如下液体培养基(g/L):葡萄糖20.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10%(w/v) Na2CO3 100ml，培养基初始 pH 值为 10. O00固体平板培养基在上述液体培养基中添加15克/升的琼脂。发酵培养基(g/L):葡萄糖20.0，酵母粉5，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0，MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 0-200，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10%(w/v) Na2CO3 IOOml 1，培养基初始 pH 值为 10. O。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤( I)斜面培养同实施例2 ；(2)种子培养同实施例2 ；(3)发酵培养在装有50ml含有不同NaCl浓度发酵培养基的IOOml三角瓶中接入3ml步骤(2)的种子养液，放置于37°C静置培养72小吋，结束发酵。上述发酵培养基中NaCl 浓度分别为む/1):0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200。发酵结束时，取发酵液，6000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中L-乳酸浓度。实验重复进行三次。在不同浓度NaCl条件下的产酸情况分别为0g/L的NaCl条件下，乳酸产量为15g/L ；50g/L的NaCl条件下，乳酸产量为16g/L ；100g/L的NaCl条件下，乳酸产量为14g/L ；120g/L的NaCl条件下，乳酸产量为2g/L ；140g/L的NaCl条件下，乳酸产量为lg/L ；NaCl浓度超过150g/L后,菌体不产酸。这ー结果表明，金橙黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantiacum)8-ll-lCGMCC No. 6154 可以最高耐受 140g/L 的 NaCl，并且在 100g/L 的 NaCl条件下，乳酸发酵水平没有明显降低，显示了该菌良好的钠盐耐受能力，具有エ业应用潜力。实施例4、金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154直接利用葡萄糖发酵生产L-乳酸的最佳反应pH值的測定(发酵罐)本实施例中所用的培养基的组成如下液体培养基(克/升)葡萄糖20.0，酵母粉5，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0， MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10%(w/V) Na2CO3 100ml，培养基初始pH值为10. O。固体平板培养基在上述液体培养基中添加15克/升的琼脂。发酵培养基(克/升):葡萄糖 120. 0，酵母粉20,K2HPO4 *3H20 2. 0，MgSO4 *7H200. 35，无水こ酸钠I,MnSO4 .H2OO. 03,蒸懼水900ml, 115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10%(w/v) Na2CO3 100ml，调节培养基初始 pH 值为 6. 5,7. 5,8. 5,9. 5 或 10. 5。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤( I)斜面培养同实施例2 ；(2)种子培养同实施例2 ；(3)发酵培养上海保兴BIOTECH 5升发酵罐中加入配制为2. OL但定溶到I. 8升的发酵培养基，在发酵培养基中接入200ml步骤(2)获得的种子培养液，使用3M的HCl和15M的NaOH溶液控制整个发酵过程中的pH值恒定为6. 5,7. 5,8. 5,9. 5或10. 5，37°C培养12小时，搅拌转速50转/分，搅拌半径38mm。发酵结束时，取发酵液，6000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中L-乳酸浓度。实验重复进行三次。在pH 6. 5的条件下，L-乳酸的发酵浓度为5. 3g/L ；pH 7. 5的条件下，L-乳酸的发酵浓度为37. Og/L ；pH 8. 5的条件下，L-乳酸的发酵浓度为58. 7g/L ；pH 9. 5的条件下，L-乳酸的发酵浓度为57. 7g/L ；pH 10. 5的条件下，L-乳酸的发酵浓度为9. 7g/L。这ー结果表明，金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-ll_lCGMCC No. 6154利用葡萄糖为唯一碳源直接发酵生产L-乳酸的最佳控制pH值为8. 5-9. 5，从减少NaOH用量，控制生产成本的角度考虑，最佳的控制pH值为8. 5。实施例5、金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154利用葡萄糖单次补料发酵生产L-乳酸(发酵罐)
本实施例中所用的培养基的组成如下液体培养基(克/升)葡萄糖20. 0，酵母粉5. 0，聚蛋白胨5. 0，K2HPO4 3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10%(w/V) Na2CO3 100ml，培养基初始pH值为10. O。固体平板培养基在上述液体培养基中添加15克/升的琼脂。发酵培养基(克/ 升):葡萄糖 80.0，酵母粉 20，K2HPO4 3H20 2.0，MgSO4 7H200. 35,MnSO4 .H2OO. 03，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌10分钟后加入高温灭菌的10% (w/V) Na2CO3 100ml，培养基初始pH值为8. 5。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤(I)斜面培养同实施例2 ；(2)种子培养同实施例2 ；(3)发酵培养上海保兴BIOTECH 5升发酵罐中加入配制为2. OL但定溶到I. 8升的发酵培养基，在发酵培养基中接入200ml步骤(2)获得的种子培养液，使用3MHC1和15M的NaOH溶液控制整个发酵过程中的pH值恒定为8. 5 ;采用多次脉冲补料方式，具体为，初始葡萄糖浓度为80克/升，当发酵液中葡萄糖的浓度低于20克/升时，则一次加入800-1000克/升葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度重新达到80克/升，在整个发酵过程中，需要多次补料操作。37°C培养43小吋，搅拌转速50转/分，搅拌半径38mm。发酵结束吋，取发酵液，10, 000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中L-乳酸浓度及其光学纯度、糖酸转化率。同时在发酵过程中，定时取样，检测发酵液中L-乳酸的浓度以及葡萄糖的消耗情況。实验重复三次，结果取平均值。结果如图I和表I所示，金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No. 6154生产L-乳酸，以葡萄糖为底物，在37°C条件下直接发酵生产L-乳酸，43小时内，L-乳酸浓度为133克/升，光学纯度大于99. 9%，转化率超过93%。本发明所提供的金澄黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 可用氢氧化钠调酸，发酵生产高光学纯L-乳酸，有利于降低L-乳酸纯化成本，减少环境污染，具有重要的实际エ业应用价值。表I利用葡萄糖发酵L-乳酸3次重复实验的结果
权利要求
1.金橙黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 6154。
2.一种菌剂，其特征在于所述菌剂的活性成分为权利要求I所述的金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No. 6154。
3.一种生产L-乳酸的方法，是发酵培养权利要求I所述的金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154,或权利要求 2 所述的菌剂，得到L-乳酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养的pH为7.5-10. 5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于调节所述发酵培养的pH的中和剂为NaOH水溶液；所述NaOH水溶液具体为浓度10-20M的NaOH水溶液。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述发酵培养的培养基中含有碳源和氮源；所述碳源为终浓度为20克/升-150克/升的葡萄糖；所述氮源为终浓度为5克/升-50克/升的酵母粉。
7.根据权利要求6中所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养基中还含有终浓度大于0克/升小于等于0. 4克/升的MgSO4 7H20、终浓度大于0克/升小于等于4克/升的K2HPO4 3H20、终浓度为大于0克/升小于等于5克/升的CH3C00Na、终浓度大于0克/升小于等于0. 06g克/升的MnSO4 H2O0
8.根据权利要求7中所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养基，溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、K2HPO4 3H20、MgSO4 7H20、MnSO4 H2O, NaCl 和 Na2CO3 ;所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为80g/L，所述酵母粉在所述培养基中的终浓度为20g/L，所述K2HPO4 3H20在所述培养基中的终浓度为2g/L，所述MgSO4 7H20在所述培养基中的终浓度为0. 35g/L，所述MnSO4 -H2O在所述培养基中的终浓度为0. 03g/L,所述NaCl在所述培养基中的终浓度为50g/L，所述Na2CO3在所述培养基中的终浓度为10g/L ;所述培养基的pH为8.5。
9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养的温度为30-420C ;所述发酵培养的时间是12-72小时；所述发酵培养的方式为旋转震荡培养，转速为40-60转/分钟，旋转半径为30-40mm。
10.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤将权利要求I所述的金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 作为活性成分，得到所述菌齐U。
全文摘要
本发明公开了一种生产L-乳酸的方法及其专用金橙黄微小杆菌。本发明所提供的金橙黄微小杆菌具体为金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6154。本发明所提供的金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No.6154均有良好的钠盐耐受能力；以葡萄糖为底物，采用氢氧化钠调酸方式，在37℃条件下利用其发酵生产L-乳酸，L-乳酸浓度达133克/升，光学纯度大于99.9%，糖酸转化率超过93%。本发明所提供的金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No.6154可采用氢氧化钠调酸方式发酵生产高浓度、高光学纯的L-乳酸，有利于降低乳酸纯化成本，减少环境污染，具有重要的实际工业应用价值。
文档编号C12R1/01GK102864105SQ20121035683
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者王爱妍, 薛燕芬, 姜旭, 王丽敏, 于波, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所