专利名称：昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因序列及其dsRNA的应用。
背景技术：
在我国长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂防治害虫，导致一系列问题农药残留导致农业环境污染；昆虫出现抗药性，防治成本提高；有毒农药危害人类身体健康等。目前已有将生物杀虫剂应用于害虫防治，但往往作用时间较长，效果缓慢。为更为有效地进行植物保护，迫切需要研发新型的害虫防治方法。RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅是基因功能研究方法上的突破，同时也为人类的疾 病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2008年，Price和Gatehouse总结了众多研究结果后，提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2)防治害虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。
发明内容
本发明的目的是提供一种昆虫β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其dsRNA在致死害虫中的应用。本发明提供的一种β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO
I。该序列是通过对飞蝗EST数据库的搜索，得到17条飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因基因片段，通过序列拼接和比对后，进一步克隆获得。该序列长2667bp，包含1845bp开放阅读框。本发明提供的一种昆虫β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ IDNO :2，是根据SEQ ID NO :1设计上游引物SEQ ID NO :3和下游引物SEQ ID NO :4，通过PCR扩增获得SEQ ID Ν0:2，其含有Τ7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。所述dsRNA是用上游引物SEQ ID NO 3和下游引物SEQ ID NO 4合成PCR产物，经Wizardrft'SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)试剂盒纯化后按照 T7RiboMAXTMExpress RNAi System (Promega)试剂盒说明体外转录合成。SEQ ID NO 2合成的dsRNA在致死害虫中的应用注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明SEQ ID NO 2合成的dsRNA可以特异性地沉默β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAGl的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡。
图I :2龄飞蝗注射SEQ ID NO :2合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。A为注射dsGFP的对照，B为注射SEQ ID NO 2合成的dsRNA。
图2 :5龄飞蝗注射SEQ ID NO :2合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。A为注射dsGFP的对照，B为注射SEQ ID NO 2合成的dsRNA。图3 :飞蝗注射SEQ ID NO 2合成的dsRNA后飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAGl的不同时间点mRNA表达，β-actin做为内参基因。24，48，72为注射dsRNA后的小时数。**P〈0. 01。
具体实施例方式实施例I :飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段及其dsRNA的获得I、飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段的获得I)飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因在飞蝗表达序列标签EST数据库的搜索
基于飞蝗的表达序列标签(EST)数据库，采用生物信息学方法对飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得17条飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段。经拼接后，获得的飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(LmNAGl)序列全长2667bp,开放阅读框1845bp。2)飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因引物的设计基于已获得LmNAGl的碱基序列,采用primer premier5. O软件设计引物。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。3)飞蝗总RNA获得选取大小一致雌雄各半飞蝗5龄若虫，四头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒。4)第一链cDNA的合成 参照M-MLV反转录TaKaRa试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。5)飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因序列的获得根据天根MasterMix说明书进行PCR，进一步克隆获得的飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因。6)飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因碱基序列的分析利用Expasy网站中相关在线软件和GENED0C、基因探索者等软件分析所得序列，之后在NCBI网站中使用BLAST功能进行序列同源性比对。2、飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA合成I)飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA引物的设计基于本研究所得到飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的序列SEQ ID NO :1，采用primer premier5. O软件设计。设计dsRNA引物,其序列分别为SEQ ID NO :3和SEQ IDNO :4。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。2)飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA的合成上述dsRNA 引物合成 PCR 产物，经Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒纯化后按照 T7RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA。dsRNA浓度采用酶标仪SpectraMax 190测定,并浓缩至终浓度为3 μ g/μ I。实施例2 :飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA致死2龄飞蝗
I、飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA注射将I μ I (3 μ g)SEQ ID NO :2的dsRNA用25 μ I规格微量注射器注射到2龄飞蝗第2日龄若虫二、三腹节之间，共注射30只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后飞蝗置于28°C恒温生化培养箱中饲养。2、注入dsRNA后2龄飞蝗表型的观察2龄若虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组3天后开始蜕皮并全部成功蜕至三龄，平均蜕皮时间为15-20分钟，蜕至三龄后虫体形态活力正常，并于半天后开始正常进食。注射dsLmNAGl的处理组若虫共30头，与对照组若虫相比均出现延迟I天蜕皮的现象，并且蜕皮过程的持续时间均>lh，其中有9头若虫最终不能完成蜕皮导致死亡，能够蜕至三龄的处理组若虫蜕皮后出现身体柔软、活力不足、进食量减少等现象。当三龄若虫蜕至四龄时，对照组虫体仍然能够正常顺利地完成蜕皮，随后蜕至五龄乃至成虫。而处理组21头若虫中，有6头蜕皮困难而导致死亡，至此处理组若虫的死亡率达到50. 0%，蜕至四龄的若虫 最终可以发育至成虫。蜕皮困难并最终导致虫体死亡的15头若虫都出现统一的表型(图
1):头部、胸部及腹部旧表皮均能够开裂并剥离，但蜕至附肢时，新旧表皮无法分离，虫体开始出现反复挣扎，时间长达数小时，最终导致死亡。实施例3 :飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA致死5龄飞蝗I、飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA注射将2 μ I (6 μ g)SEQ ID NO :2的dsRNA用25 μ I规格微量注射器注射到5龄飞蝗第2日龄若虫二、三腹节之间，共注射40只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后飞蝗置于28°C恒温生化培养箱中饲养。2、注入dsRNA后5龄飞蝗表型的观察五龄若虫注射dsRNA后，对照组虫体3天后开始蜕皮并在注射后第5天全部成功发育至成虫,蜕皮时间约为20min，蜕皮发育为成虫后虫体状态良好。注射dsLmNAGl的处理组若虫共40头，与对照组相比未出现蜕皮延迟的现象，但蜕皮持续时间仍均>lh，其中有I头于注射后3天死亡、2头于注射后4天死亡、18头于注射后5天(即五龄第七天)死亡，仅有19头若虫能够蜕至成虫，死亡率达到52. 5%。19头死亡若虫出现三种不同的表型(图
2):第一种为蝗蝻蜕皮时仅前胸背板及头部沿脊线开裂少许，开裂部分可见新表皮，后腹部仅蜕出一小段从而死亡；第二种表型是附肢新旧表皮无法分离，且新翅也无法从旧表皮翅芽中蜕出；第三种则是前胸背板脊线开裂部分增大，可一直延长至下腹部背板，前胸背板处新表皮胀裂,体液溢出导致虫体死亡。以上三种表型出现的几率基本相同。3、飞蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因沉默检测对于5龄dsRNA注射后不同时间点的沉默效率检测，选择注射后24h、48h和72h的整虫虫体作为RNA提取对象，每组各个时间点设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成第一链cDNA，用RT-PCR和Real-time PCR检测目的基因(LmNAGl)和管家基因(β -actin)的相对表达量，以计算目的基因的沉默效率(图3)。
权利要求
1.一种昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID Ν0:1。
2.一种昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID Ν0:2。
3.如权利要求2所述的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，含有Τ7启动子。
4.如权利要求2所述的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因合成的dsRNA，所述dsRNA是用上游引物SEQ ID NO :3和下游引物SEQ ID NO :4合成PCR产物，经fizard SV Gel andPCR Clean-Up System (Promega)试剂盒纯化后按照 T7RiboMAX Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成。
5.如权利要求5所述的dsRNA在致死蝗虫中的应用。
全文摘要
本发明提供一种昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(NAG)的序列及其双链RNA(dsRNA)的应用方法，它可沉默特定的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，使害虫死亡。对飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因进行克隆和测序后，得到序列为SEQ ID NO1的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因；然后选择序列为SEQ ID NO2的该基因片段，用于dsRNA的合成。该基因dsRNA注入昆虫体腔后，昆虫生长过程发育迟缓；无法顺利蜕皮进入下一龄期，导致死亡。本发明为基于RNA干扰的害虫防治提供新的靶标。
文档编号C12N15/56GK102876691SQ20121035667
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者李大琪, 容烁, 李涛, 张建珍, 马恩波 申请人:山西大学